蜡梅水通道蛋白基因.docVIP

蜡梅水通道蛋白基因（CpAQP）分子特征分析 及植物表达载体的构建 张迷，马婧，马鑫，胡雨晴，眭顺照，李名扬 西南大学园艺园林学院，西南大学花卉研究所，重庆，400715 摘要：在已构建的蜡梅花cDNA文库及EST分析的基础上，通过对文库cDNA克隆全长测序，得到了个蜡梅蛋白基因cDNA全长1154 bp，最大ORF 810 bp，编码269个氨基酸。聚类分析和同源性比对表明，该蛋白基因属于TIPs亚族类，具有高度保守的MIP家族结构域。该蛋白具有6个跨膜结构，N-末端和C-末端都在细胞内。利用NetPhos2.0对CpAQP蛋白进行磷酸化位点预测，该蛋白C端丝氨酸磷酸化，可能在植物胁迫和亚细胞定位中起着重要作用。将该基因的cDNA编码序列连接到植物表达载体pCAMBIA2301g中，成功构建了CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP，为进一步通过转基因技术研究该基因的功能奠定了基础。 关键词：蜡梅；水通道蛋白；分子特征；植物表达载体 水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)又称水孔蛋白，是广泛存在于原核和真核生物细胞膜上转运水的特异蛋白孔道[1]。植物水通道蛋白是一个超家族：到目前为止，在拟南芥、烟草、玉米等多种植物中都发现了AQPs并得到克隆玉米中36种，拟南芥中有35种[]，水稻中有33种。4种类型[6]，质膜内在蛋白PIPs(plasma membrane intrinsic proteins)、液泡膜内在蛋白TIPs(tonoplast intrinsic proteins)、根瘤菌周膜上的NOD26类似的内在蛋白NIPs(NOD26-like intrinsic proteins)以及一类小分子碱性内在蛋白SIPs(small basic intrinsic proteins)。水通道蛋白在水分调节以及各种生理反应，如气孔开关、器官运动、细胞生长和生物胁迫反应等方面起着重要作用[7]。 蜡梅(Chimonanthus praecox)是蜡梅科蜡梅属落叶丛生灌木一种具有耐寒、耐旱多抗特性的物种cDNA文库中随机测序克隆得到一个蜡梅水通道蛋白基因，命名为CpAQP，并对其进行了序列特征分析。通过分子克隆技术，构建了一个含CpAQP基因的植物表达载体pCAM-CpAQP，为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。 1. 材料方法 以磬口蜡梅花的各个时期（蕾期、露瓣期、初开期、盛花期）为材料构建的混合cDNA文库，由本实验室构建、保存。主要试剂 Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mg、dNTP、T4 DNA连接酶等购自公司；Maker DL2000等试剂购自北京天为时代科技有限公司；质粒提取和胶回收试剂盒购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序由生物工程有限公司成；氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)和卡拉霉素(Kanamycin, Km)购自上海生物工程有限公司。菌株与载体Escherichia coli）菌株TOP10，根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404，植物表达载体pCAMBIA2301g（Km抗性）等均由本实验室保存。克隆载体pMD19-T购自随机挑选文库克隆提取质粒DNA以5′pTriplEx2Sequenceprimer为测序引物采用ABI3700DNA自动序列测定仪进行正向序列测定得到EST序列然后运用DNAStar软件包的SeqMan进行EST聚类运行BLASTX与nr库进行比对获得目标克隆子，再以SP5和T7为测序引物进行两次正反向序列测定CpAQP基因TCTAGAATGCCCATTTCTCGGATTGCA-3’，添加Xba I酶切位点；下游引物：5‘-GAGCTCTCAAAGACAACAAAGATGCGC-3’，添加Sac I酶切位点，下划线部分表示添加的酶切位点。 以蜡梅DNA和cDNA为模板，建立25 μl PCR反应体系，10×PCR缓冲液2.5 μL，25 mM MgμL，2.5 mM dNTP1.5 μL，引物终浓度为10 μmol/L模板DNA为1 μLTaq DNA聚合酶1UddH2O15.8 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性2℃退火72℃延伸min，28个循环最后72延伸10 min。pMD19-T连接，转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在含有氨苄青霉素（Amp）的LB培养基上培养，挑选重组克隆，选取PCR检测阳性单克隆，测序上海生物工程公司。生物信息分析主要采用DNAMAN4.0和DNAStar7.0软件包进行。ProtScale分析蛋白疏水性，利用SignalP分析蛋白信号肽。pMD19-T连接，构建中间载体pMD-CpAQP，然后转化大肠杆菌TOP10感受态细胞，在含有氨苄青霉素（Amp