阿瓦斯汀三维构象酶联免疫吸附检测试剂盒（avabridge）说明书.pdfVIP

阿瓦斯汀三维构象酶联免疫吸附检测试剂盒（AvaBridge ）说明书 产品目录编号 AB00201-1 此试剂盒包含检测阿瓦斯汀 （Avastin ）原创药与仿制药间三维构象相似性 （comparability ）所需要的全部组分。 请在操作之前仔细阅读此说明书。 本试剂盒只能用于科学研究，不能用于医学诊断。 背景资料 贝伐单抗 （Bevacizumab）商品名为阿瓦斯汀 （Avastin ），是一种人源化的单克隆抗体 （humanized monoclonal antibody）药物，原创药由 Genentech 生产，作用靶点是血管内皮 生长因子A （vascular endothelial growth factor A ，VEGF-A) 。血管内皮生长因子A 是人体内刺 激血管增生的重要因子，在多种疾病特别是癌症中起着重要作用。2004 年贝伐单抗获得FDA 批准，成为美国首个获得批准上市的抑制肿瘤血管生成的药物，贝伐单抗联合化疗可改善 大肠癌患者总体生存率。此试剂盒专门用于检测阿瓦斯汀（Avastin ）原创药（Bevacizumab） 与仿制药（biosimilar ）间三维构象的相似性（comparability ）。 1 分析测定原理 此检测盒采用双抗体夹心酶联免疫吸附法进行检测。首先根据贝伐单抗的氨基酸序列 设计多肽抗原并制备相应的多肽抗体，然后用多肽抗体包被96孔平板。在PBS （pH 7.4 ）中， 每一种多肽抗体都能灵敏的识别其对应的多肽抗原。但是在正确折叠的贝伐单抗分子中， 大多数抗原决定簇 （epitopes ）被单抗三维结构所掩盖，只有少数抗原决定簇暴露于单抗 分子表面，因此只有少数的多肽抗体能有效的识别正确折叠的单抗分子上对应的抗原决定 簇，而大多数多肽抗体识别信号相对较弱。分析结果可用两个柱状图（Histogram）表示， 若对原创药分子作图，则此图可作为该分子正确三维构象的“指纹”（fingerprint ）。如果 仿制药也能正确折叠和糖基化，则其测定结果应与原创药的柱状图高度相似。但若仿制药 在表达、纯化等过程中三维构象发生变化使原来被掩盖的抗原决定簇暴露出来，则测定结 果不同，通过比较仿制药与原创药“指纹”的差异就可找出两者在何处三维构象不同。 分析是在96孔平板中进行，首先将阿瓦斯汀的仿制药和原创药（Bevacizumab）分别配 制为5 µg/ml 的溶液，然后分别加到平板中去。经过1小时的保温，仿制药和原创药的一部 分分子会与平板中的多肽抗体形成复合物。此复合物被随后加入的生物素标记的抗人多克 隆抗体结合并进一步形成更高级的复合物，抗人多抗加入后室温反应1小时，洗去未结合 的物质，再加入链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物，静置45分钟。因链霉亲合素可以与任 何带生物素标记的抗体相结合，从而使链霉亲合素-辣根过氧化物酶复合物连接到平板上。 接下来冲洗掉未结合的物质，加入TMB底物。固相上的酶催化底物产生颜色反应，待颜色 反应一段时间后，终止反应。用酶标仪在450 nm波长下测定其结果，此结果能间接地反应 结合到平板上的仿制药或原创药分子数量的多少，由此可推测出仿制药和原创药三维构象 的异同。本说明书后面的附图1和附图2是一个用原创药 （Bevacizumab ）通过双抗体夹心酶 联免疫吸附法检测的实例。 2 Figure 1. Bevacizumab Conformational Array ELISA from Variable Region 0.5 0.4 m n 0.3 0 5 4 D 0.2 O 0.1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 1 b b b b b b b b b 1 1 A A