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第28卷第11期 水 产 科 学 VoI．28No．11 2009年11月 FISHERIESSCIENCE NOV．2009 抗冻蛋白AFPIlI的原核表达、纯化及 多克隆抗体的制备 郝凤霞1，胡文革1，付伟超2，康庄丽1，张桂玲1 (1．新疆石河子大学生命科学学院，新疆石河子832002；2．新疆石河子大学食品 科学学院，新疆石河子832000) 摘要：采用基因重组技术将AFPUl基因与原核表达载体pET32a(+)连接．转化大肠杆菌BL21 (DE3)。通过PCR、单双酶切及测序鉴定构建结果。用IPTG诱导蛋白表达。将融合蛋白纯化后。免疫6 —7周龄的小白鼠，制备AFPIll多克隆抗体．采用Western印迹法检验抗体特异性。通过酶联免疫吸 附试验(ELISA)测定多克隆抗体滴度。成功地构建了AFPIll的原核表达载体。经在大肠杆菌中诱导表 000 达、镍柱亲和层析纯化，得到较纯的相对分子质量约26 Da的融合蛋白。免疫小白鼠后得到多抗血 清。Western印迹结果显示此多克隆抗体与AFPm蛋白特异性结合。该试验为进一步研究AFPIll在 转基因鱼中的定点表达以及作用机制奠定了基础。 关键词：抗冻蛋白；原核表达；重组融合蛋白；纯化；抗体 中图分类号：Q5l 文献标识码：A 文章编号：1003-1111(2009)11-0671—04 抗冻蛋白是一类抑制冰晶生长的蛋白质，能以 使目的蛋白的高效表达后得到纯化的融合蛋白，构 非依数性(Noncolligative)形式降低水溶液的冰建了能利用组氨酸标签的原核表达载体，应用了亲 点，但对熔点影响甚微，从而导致水溶液的熔点和 和层析技术对融合组氨酸标签的表达产物进一步 冰点之间出现差值，这种差值称为热滞活性或抗冻 纯化，获得有活性的重组蛋白，直接用于蛋白功能 活性，差值越大，抗冻活性越大，因此抗冻蛋白亦称 的研究L5j。 为热滞蛋白(Thermal Proteins，THPs) Hysteresis 1材料与方法 或温度迟滞蛋白。其抗冻活性的大小用THA来 表示[1]。AFPⅢ是抗冻蛋白的一种，为球状结构的1．1材料及仪器 蛋白分子，分子组成和顺序与其他的抗冻蛋白完全 不同，没有占优势的非极性氨基酸。其二级结构主 发育研究所陈良标教授惠赠。本实验室将该质粒 要是由9个口一折叠组成，其中8个折叠组成一种B 折叠三睨治夹心结构，另一个则游离在外。其三级 richia 结构由3个8折叠反向排列成川字形，两个川字形 本实验室保存。试验动物昆明系小白鼠购自石河 结构互相垂直排列成三级结构的主体部分，其余B 子大学医学院实验动物中心。 Ni-NTA 折叠则处于连接位置上[2]。研究还发现，抗冻蛋白 High-AffinityAgarose纯化试剂盒 的冰晶结合位点扁平，具有刚性侧链和骨架，能减 购自QIAGEN 少立体位阻，利于与冰晶形成多个氢键、范德华键 DNA聚合酶、DNA 和盐键，有稳定AFPⅢa一螺旋作用[3。]。由于其特 殊的结构和功能，从其发现以来，就引起了各国学 封闭液、增强型HRP—DAB底物显色试剂盒均购自 者的广泛重视。目前很多学者从事抗冻蛋白基因 天根生化(北京)科技有限公司；DNA回收试剂盒 工程的研究，期望能够改良某些生物的抗冻性能。 购自北京百泰克生物技术有限公司；限制性内切酶