提取胰蛋白酶.doc

胰蛋白酶的提取原理和方法步骤 2010-03-29 14:21:31 来源：HYPERLINK 易生物实验 浏览次数：404 HYPERLINK /comment/?keyid=phpcms-content-title-4284verify=3b7395cf3589cd04a52e60effffc81e2网友评论 0 条 在动物胰脏中除了存在胰蛋白酶外，还有另外两种与胰蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。 关键词：HYPERLINK /tag.php?tag=??胰蛋白酶HYPERLINK /tag.php?tag=trypsintrypsin ［原理］在动物胰脏中除了存在胰HYPERLINK /yp/product-list-470.html蛋白酶外，还有另外两种与胰HYPERLINK /yp/product-list-470.html蛋白酶性质相似的蛋白水解酶：胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。在胰蛋白酶提取过程中，三者彼此很难分开。需采用合适的方法进一步分离纯化。从动物胰脏中提取胰蛋白酶，一般是用稀酸将胰腺细胞中含有的胰蛋白酶原提取出来，然后根据等电点沉淀的原理将提取液的pH值调至酸性（pH3.0左右），使大量的酸性蛋白沉淀出来。经硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原、胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原沉淀。沉淀物经水溶解并调至pH8.0，用极少量的胰蛋白酶将胰蛋白酶原激活，同时溶液中的胰凝乳蛋白酶原和弹性蛋白酶原也被激活，三种酶原相互作用过程如下： 也可采用从胰脏中提取出胰蛋白酶原，利用合适的提取溶液的pH值促使胰蛋白酶原部分自溶，并通过溶液中Ca2+的环境，使胰蛋白酶原被开始自溶的少量具有活性的胰蛋白酶所激活，转变为具有活性的胰蛋白酶（胰凝乳蛋白酶原及弹性蛋白酶原亦同时被胰蛋白酶激活成有活性的酶）。激活后的酶溶液再进一步分离纯化。［试剂和器材］1、试剂（1）pH2.5～3.0乙酸化的水溶液（2）10%（体积分数）乙酸（3）2mol/L硫酸（4）固体硫酸铵（5）无水CaCl2（6）结晶胰蛋白酶（7）25%乙醇溶液(含 0.015mol/ＬHCl 、0.05mol/ＬCaCl2)（8）95%（体积分数）乙醇（9）5mol/Ｌ NaOH（10）丙酮2、器材（1）胰脏（2）组织捣碎机（3）HYPERLINK /yp/product-list-47.html离心机（4）磁力HYPERLINK /yp/product-list-51.html搅拌器（5）HYPERLINK /yp/product-list-975.html透析袋、20目筛网、纱布、HYPERLINK /yp/product-list-56.html水浴锅（6）HYPERLINK /yp/product-list-912.html烧杯、HYPERLINK /yp/product-list-914.html量筒、刻度HYPERLINK /yp/product-list-963.html吸管、HYPERLINK /yp/product-list-952.html试管、玻璃HYPERLINK /yp/product-list-913.html漏斗（7）布氏HYPERLINK /yp/product-list-913.html漏斗、抽滤瓶、HYPERLINK /yp/product-list-68.html温度计、滴管、玻璃搅棒、纱布、pHHYPERLINK /yp/product-list-924.html试纸等［方法和步骤］方法一1、 胰蛋白酶原的提取取新鲜胰脏约150g，剥去结缔组织和脂肪，取净重100g，切成碎块，在组织捣碎机中捣碎，并加入2倍体积预冷的pH2.5～3.0 乙酸化水溶液，制成匀浆。浆液倒入500mLHYPERLINK /yp/product-list-912.html烧杯中，用10%（体积分数）乙酸调节pH在2.5～3.0之间，在5～10℃下提取6h以上，并间隙轻轻搅拌。用4层纱布过滤，尽量挤出滤液。组织残渣中再加入0.5倍体积（约50mL左右）预冷的pH2.5～3.0乙酸化水溶液再提取一次（放置1～2h），再用4层纱布过滤。合并两次滤液，用2.5mol/L硫酸调节滤液pH在2.5～3.0之间，4℃放置4h（pH始终保持在2.5～3.0），使提取液中酸性蛋白沉淀析出。提取液用折叠HYPERLINK /yp/product-list-976.html滤纸于玻璃漏斗中自然过滤，收集滤液，量取体积（约200mL左右）。滤液中加入粉末状固体硫酸铵，使溶液达 0.75饱和度（每升滤液加492g，5℃）。放置过夜，使胰蛋白酶原完