人周血淋巴细胞分离液技术要求.doc.docVIP

人外周血淋巴细胞分离液产品技术要求 3.1 产品规格及其划分说明 250ml/瓶、500ml/瓶、 3.2 性能指标 3.2.1 外观 乳光或微乳光液体。 3.2.2 澄清度 比重1.077 – 1.080 g/mL 3.2.3 pH值（每升标示量/L） pH要求为7.1～7.3，允许偏差范围为±0.30。 3.2.4 渗透压/（m0sm/kgH2O） 渗透压为280～340 m0sm/kgH2O 3.2.5 细菌内毒素/（EU/ml） ﹤0.5 3.2.6 无菌检查 3.2.6.1 细菌数 不得检出 3.2.6.2霉菌数 不得检出 3.2.7 细胞分离实验 3.2.7.1 细胞形态 正常。 3.2.7.2细胞分离数量及存活率 数量：90%-95%；存活率：95%-98% 3.2.8 安全性检验项目 抗生素：不得检出。 3.3 检验方法 3.3.1外观检测方法 肉眼观察为乳光或微乳光液体 3.3.2 澄清度的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ B进行。 3.3.3 pH值的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅵ H进行。 3.3.4 渗透压的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅸ G进行。 取两次平行测定结果的算术平均值为测定结果，两次平行测定结果的绝对差值不大于这两个测定值的算术平均值的5℅。 3.3.5 细菌内毒素的测定 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅺ E细菌内毒素检查法中的凝胶法进行。 3.3.6 无菌检查 按中华人民共和国药典2010年版二部附录Ⅺ H无菌检查法进行，检查项目为细菌数、霉菌数。检测法采用平皿法。 3.3.7 人周边血淋巴细胞分离计数及存活率检测实验 3.3.7.1 人周边血细胞分离实验 3.3.7.1.1方法提要 1）本实验所用容器具及溶液均为无菌，实验操作过程均为无菌操作。 2）分离外周血，并计数分离所得细胞及细胞存活率 3.3.7.1.2 实验试剂和材料 1）人外周血：新鲜血5ml(加肝素抗凝20u/ml) 2）分离液：本产品样品 3）1640无血清培养液 4）10%NCS 5）3%冰醋酸 6）台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒 3.3.7.1.3 仪器 1）医用超级洁净工作台：洁净级别为百级。 2）二氧化碳恒温培养箱：能通二氧化碳气体并且保持二氧化碳体积分数为（5±0.1）℅，能在（37±1）℃恒温。 3）细胞培养瓶：T25型、无菌。 4）玻璃试管 5）血球计数板 6）盖玻片：无水乙醇浸泡并擦干。 7）水平离心机 3.3.7.1.4 实验步骤 1）分离人周血淋巴细胞 A 新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1?稀释?在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些 ）小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。?离心转速?：1500/分温度20℃－28时间：20分钟（不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞?层又弄混了，加速度也最好不要太大)取出试管，看看是不是分为好几层顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，用用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）离心。?转速：2000－2300/min?（转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开)时间：10分钟温度：4I震荡后，用培养液重悬至1ml取100ul放于96孔板中留着计数用然后细胞悬液在离心机上离心计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形.a.?取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）b.?从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞c.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形d.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x?104?x?4?得到的就是细胞的浓度e?细胞总数是：细胞浓度x1ml培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-2重组人白介素-225－50u/孔后，放入培养箱 3）细胞存活率 用台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒检测分离的淋巴细胞存活率 A台盼蓝染色： 吸取100μl重悬的细胞到常规1.5ml或0.5ml离心管内， 加入100μl Trypan Blue stain轻轻混匀，染