酶法测定人尿中L瓜氨酸含量.pdfVIP

维普资讯 第34卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报 第3期 2006年 3月 ChineseJournalofAnalyticalChemist~ 379—381 酶法测定人尿中L·瓜氨酸含量 李加友 曹 瑜 刘 茜 焦庆才 (南京大学生命科学学院医药生物技术国家重点实验室，南京210093) 摘 要 ￡-瓜氨酸是人体多种疾病的重要检测指标 利用鸟氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶对 ￡．瓜氨酸的 专～性作用，建立了一种准确、简便、灵敏的￡．瓜氨酸含量酶法测定方法。较为适宜的酶转化条件是：30~C～ 35E，pH6—7。固定化酶有较高的稳定性，4℃保存60d后酶活回收率仍高达95％。该方法测定 瓜氨酸的 线性范围为2—10mg／L；7作曲线回归系数r=O．9987；样品回收率达99％以上。 关键词 ￡-瓜氨酸，酶法，氨 1 引 言 一 瓜氨酸是人体尿素循环的中间产物，与人体内氨氮排泄有非常重要的关系…。 ．瓜氨酸在体液 中含量水平是多种疾病检测的重要指标 】。已报道的 ．瓜氨酸检测方法有阿氏法 ]、HPLC法[6和 薄层扫描法 。阿氏法和薄层扫描法灵敏度都不高，当 ．瓜氨酸浓度低于0．02g／L时不能准确检出， 故不能用于低浓度的 一瓜氨酸样品测定。HPLC法灵敏度高，测定精确，但由于 ．瓜氨酸侧链为亚氨 基，易与衍生化试剂反应，所以衍生化时反应条件的精确控制难度较大，使得 HPLC法的实际操作变得 困难 。 由于酶作用的高度专一性，体液物质的酶法定量测定受到极大重视l8．9J。 ．瓜氨酸的酶法测定指的 是利用鸟氨酸甲氨酰转移酶 (omithinetransearbamoylase，EC2．1．3．3)和氨甲酰激酶 (earbamatekinase， EC2．7．2．2)转化 -瓜氨酸为 鸟·氨酸、氨和二氧化碳，且底物 一瓜氨酸与产物氨是等物质量关系。因 此，通过测定体系中氨量就可以得知 -瓜氨酸的量。而氨的测定已经有多种快速、精确的便捷方 法¨ J。本实验采用的氨测定方法，常温下，水溶性NH：在强碱性介质中与次氯酸钠和水杨酸作用， 由于亚硝基铁氰化钠的催化作用，生成稳定的水溶性蓝色络合物，可进行比色测定 ¨。基于鸟氨酸甲 氨酰转移酶对 一瓜氨酸作用的高度专一性，建立了灵敏、精确的 ．瓜氨酸酶法测定方法。通过对含高 活力鸟氨酸甲氨酰转移酶和氨甲酰激酶的菌体细胞进行固定化处理，使得转化过程变得易于操作，并且 酶的稳定性得到提高，使用寿命延长。 2 实验部分 2．1 仪器与试剂 U-3000分光光度计 (日本 日立公司)。固定化细胞：取 lg新鲜 NJ402菌体 (含高活力鸟氨酸甲氨 酰转移酶和氨甲酰激酶)，混于 lOOmL浓度为30g／L的海藻酸钠溶液中，搅拌均匀，然后逐滴滴人 300mL浓度为30g／L的CaCI溶液中固化成型。放置2h，滤出胶粒，用蒸馏水充分冲洗3次，即得可 用于 一瓜氨酸转化的固定化细胞。置4~C保藏备用。 -瓜氨酸标准液的配制：准确称取 一瓜氨酸0．05g 溶于50mL蒸馏水 中作为贮液 (1g／L)，取贮液 5是 mL用蒸馏水定容至 100mL作为操作液 (0．o5g／L)。水杨酸溶液：溶解柠檬酸钠 10g和水杨酸 l0g于适量水中，再加入 NaOH(2mol／L) 36mL，加热至完全溶解，冷却后定容至200mL。亚硝基铁氰化钠溶液：将 亚硝基铁氰化钠 (Na2[Fe(CN)5NO]．2H2O)100mg溶解于10mL水中，置于棕色瓶低温保存备用。0．7moL／LNaC10。 2．2 实验方法 在一系列干净试管中，分别加入所需用量 一瓜氨酸操作液或其他样品，蒸馏水定容至10mL，加入 2005_05_05收稿；2005-07-18接受 本文系国家技术创新基金(No．02CJ．13．16)和南京大学医药生物技术国家重点实验室开放基金资助 维普资讯 分 析 化 学