PEG在线定点修饰水蛭素及其修饰位点的理论预测与分析.pdfVIP

V01．30 高等学校化学学报 No．7 2009年7月 CHEMICALJOURNALOFCHINESEUNIVERSITIES 1410一1416 PEG在线定点修饰水蛭素及其修饰 位点的理论预测与分析 赵军，李雪芹，修志龙 (大连理工大学环境与生命学院生物科学与工程系，大连116024) 摘要 比较了液相和固相修饰水蛭素的实验结果，并在实验的基础上对水蛭素以及水蛭素／凝血酶复合物进 行分子动力学模拟，分析了容易被修饰的水蛭素赖氨酸残基的位点．结果表明，在液相修饰的时候，水蛭素 在水溶液中可被修饰的赖氨酸残基除Lys47外，都容易被修饰．而在固相修饰的时候，水蛭素仅Lys35和 Lys27容易被修饰． 关键词水蛭素；分子动力学模拟；聚乙二醇(PEG)修饰；溶液可及表面积 中图分类号0643 文献标识码A 文章编号0251-0790(2009)07．1410-07 水蛭素是65个氨基酸残基的单链多肽，具有良好的抗凝血性质…．水蛭素分子可分为N和c两 个功能域．N域有3个二硫键，结构紧密，c域的柔性很大．水蛭素的N域与凝血酶的活性位点作用， 而柔性很大的c域则与凝血酶的纤维蛋白酶原识别位点作用．c域和N域与凝血酶不同部位的协同作 用使得水蛭素／凝血酶复合体很稳定口J．水蛭素是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂，但由 于其血浆半衰期很短，严重限制了其在临床上的应用．聚乙二醇(PEG)修饰是常用的提高蛋白和多肽 类药物血浆半衰期的方法，关于水蛭素的聚乙二醇修饰，已开展了一些研究工作旧’4J．目前所用修饰方 法可分为液相修饰和固相修饰．液相修饰即在溶液中对水蛭素进行PEG修饰．PEG修饰水蛭素的位点 通常是赖氨酸残基，但由于水蛭素的赖氨酸残基较多，在液相修饰中，各修饰位点暴露在溶液中，导 致修饰产物比较杂．固相修饰利用离子交换树脂将水蛭素吸附在树脂表面，然后再加入活化的PEG， 使其与水蛭素进行反应，由于空间位阻屏蔽一些潜在的反应位点，从而达到定点修饰的目的． 水蛭素的65个氨基酸残基中有18个是侧链可电离的带电氨基酸，而且c域(49—65位)带负电 荷的残基分布很密，这样的残基分布使水蛭素在不同pH下产生构象变化，构象的不同会影响修饰的 效果，从而得到不同的修饰产物．分析不同pH条件下水蛭素可能被修饰的位点，有助于确定定点修饰 的条件，获得更多的单修饰产物．然而研究蛋白质分子在溶液中的结构和动力学性质非常困难，而新 近发展起来的计算化学、计算机辅助药物设计和模拟提供了有力的研究手段．其中，用分子动力学研 究蛋白质的性质已经成为研究的热点，并且得出了很多有意义的结果【5]， 本文在比较液相和固相修饰水蛭素的实验结果基础上，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液 相和固相修饰的位点，为理解两种不同修饰方法所得结果的差异以及通过实验确定修饰产物的组成和 修饰位点提供理论依据． 1实验与计算方法 1．1实验样品 重组水蛭素购于重庆科润生物医药研发有限公司． 京键凯科技有限公司，凝血酶购自浙江杭康医药有限公司，血纤维蛋白酶原购自Sigma公司，甘氨酸 收稿日期：2008-03-28． 基金项目：国家自然科学基金(批准号资助． 联系人简介：修志龙，男，博士，教授，博士生导师，主要从事生物催化转化与生物分离研究．E．mail：zhlxiu@dlut．edu．ca 万方数据万方数据 N0．7 赵军等：PEG在线定点修饰水蛭素及其修饰位点的理论预测与分析 购自Amresco公司，丙烯酰胺以及TEMED由Biomol公司提供，离子交换柱HiTrapQHP购自法玛西亚 生物医疗科学公司，其它试剂和药品均为分析纯． 1．2液相修饰水蛭素 mL20 将2 HV2与SC—mPEG5000以摩尔比(1：3)于4mmol／L磷酸盐缓冲溶液中(PBS)反应． mg mmol／ K，反应1