固体纤维素酶滤纸酶活力.docxVIP

实验三固体纤维素酶滤纸酶活力(FPA)的测定方法一、目的了解纤维素酶的种类和测定原理，掌握其活力的测定方法。二、原理 1. 纤维素酶是一类分解纤维素的复合酶，目前公认的有四种:（1）内切β-1,4-葡聚糖酶；（2）外切β-1,4-葡聚糖酶；（3）纤维二糖水解酶；（4）纤维二糖酶（β-葡聚糖苷酶。 2. 纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成红棕色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。由不同底物测得的酶活力分别称作FPA (滤纸糖酶活力) 和CMCA (羧甲基纤维素酶活力)。纤维素酶在一定温度和pH条件下，将纤维素底物(滤纸)水解，释放出还原糖。在碱性、煮沸条件下，3，5一二硝基水杨酸(DNS试剂)与还原糖发生显色反应，其颜色的深浅与还原糖(以葡萄糖计)含量成正比。通过在540 nm测其吸光度，可得到产生还原糖的量，计算出纤维素酶的滤纸酶活力。以此代表纤维素酶的酶活力。酶活定义以滤纸为底物，在一定反应条件（50℃，pH4.8，恒温1h）下，以水解反应中每小时催化底物水解形成1μmol葡萄糖的酶量为一个单位（U）。三、试剂和溶液(一) 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。1. DNS试剂称取3，5一二硝基水杨酸（10+0.1）g，置于约600 mL水中，逐渐加入氢氧化钠10 g，在50℃水浴中(磁力)搅拌溶解，再依次加入酒石酸甲钠200 g、苯酚(重蒸)2g和无水亚硫酸钠5g，待全部溶解并澄清后，冷却至室温，用水定容至1000mL，过滤。贮存于棕色试剂瓶中，于暗处放置7d后使用。2.柠檬酸缓冲液，0. 05 mol/L pH 4.8(适用于酸性纤维素酶)称取一水柠檬酸4.83 g，溶于约750 mL水中，在搅拌情况下，加入柠檬酸三钠7.94g，用水定容至1000 mL。调节溶液的pH到(4.8士0.05)备用。注:也可采用pH4.8乙酸缓冲溶液:称取三水乙酸钠8. 16 g，溶于约750 ml，水中，加入乙酸2.31 ml，，用水定容至1 000 ml.调节溶液的pH到(4.810.05)备用3.葡萄糖标准贮备溶液（10mg/ml）称取于(103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1 .0g，精确至0. 1 mg，用水溶解并定容至100ml4.葡萄糖标准使用溶液分别吸取葡萄糖标准贮备溶液0. 00， 1. 00， 1.50， 2.00， 2.50， 3.00， 3.50 mL于10 ml容量瓶中，用水定容至10 mL，盖塞，摇匀备用。上述系列浓度应根据需要自行调整。5.快速定性滤纸(杭州新华一号滤纸)沪15 cm(每批滤纸，使用前用标准酶加以校正)。(二) 仪器除普通实验室仪器外，还应有:1分光光度计2酸度计精度10.01 pH3恒温水浴 (50士0.l)0C4分析天平感量0.1 mg5磁力搅拌器6秒表或定时钟7沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)8具塞刻度试管25 mL四、操作步骤4.1绘制标准曲线按表A. l规定的量，分别吸取葡萄糖标准使用溶液、缓冲溶液和DNS试剂A.2.1于各管中(每管号平行作3个样)，混匀。将标准管同时置于沸水浴中，反应10 min。取出，迅速冷却至室温，用水定容至25 mL.盖塞，混匀。用10 mm比色杯，在分光光度计波长540 nm处测量吸光度。以葡萄糖量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，获得线性回归方程。线性回归系数应在0.9990以上时方可使用(否则须重做)。表1葡萄糖标准曲线管号葡萄糖标准使用溶液缓冲液吸取量mLDNS试剂吸取量mL浓度mg/mL吸取量mg/mL00.00.02.03.011.00.51.53.021.50.51.53.032.00.51.53.042.50.51.53.053.00.51.53.063.50.51.53.04.2样品的测定4.2. 1待测酶液的制备称取固体酶样1 g，精确至0.1 mg(或吸取液体酶样1 mL，精确至0. 01 mL)，用水溶解，磁力搅拌混匀，准确稀释定容50ml(使试样液与空白液的吸光度之差恰好落在0.3-0.4范围内)，放置10 min，待测。4. 2. 2滤纸条的准备 —将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h: —将水分平衡后的滤纸制成宽I cm、质量为(5.0+5)mg的滤纸条，折成M型备用。4.3操作程序 —取四支25 mL刻度具塞试管(一支空白管，三支样品管)。 —将折成M型的滤纸条，分别放入每支试管的底部〔沿l