验10-谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定.pptVIP

实验11 谷物种子萌发时淀粉酶活力的测定 * 一 实验目的 1、了解淀粉酶的特点 2、学习淀粉酶的测定方法 * 二 实验原理 淀粉酶（amylase）主要包括α－淀粉酶和β－淀粉酶，几乎所有植物中都存在有淀粉酶，特别是萌发后的禾谷类种子淀粉酶活性最强。 α－淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下迅速钝化；而β－淀粉酶不耐热，在70℃15min则被钝化。 淀粉的水解产物麦芽糖能使3，5－二硝基水杨酸还原，生成棕红色的3－氨基－5－硝基水杨酸，540nm测定OD,淀粉酶活力的大小与产生的还原糖的量成正比。 用麦芽糖制作标准曲线，用比色法测定淀粉生成的还原糖的量，以单位重量样品在一定时间内生成的还原糖的量表示酶活力。 * 三 实验器材 1、材料：萌发的小麦种子（芽长约1cm）。 2、仪器：分光光度计；离心机；恒温水浴（37℃，70℃，100℃ 3、试剂（均为分析纯）： ●标准麦芽糖溶液（1mg/ml）：精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解并定容至100ml； ● 3，5－二硝基水杨酸(DNS试剂)：精确称取1g3，5－二硝基水杨酸，溶于20ml 12mol/L NaOH溶液中，加入50ml蒸馏水，再加入30g酒石酸钾钠，待溶解后用蒸馏水定容至100ml。盖紧瓶塞，勿使CO2进入。若溶液混浊可过滤后使用； ● 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液：A液（0.1mol/L 柠檬酸）：称取柠檬酸 21.01g，用蒸馏水溶解并定容至1L；B液（0.1mol/L 柠檬酸钠）：称取Na3C6H5O7.2H2O 29.41g，用蒸馏水溶解并定容至1L。取A液55ml与B液145ml混匀，即为0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液； ● 1％淀粉溶液：称取1g淀粉溶于100ml 0.1mol/L pH5.6的柠檬酸缓冲液中。 * 四 实验步骤 1、麦芽糖标准曲线的制作：取7支干净的具塞刻度试管，编号，按表（教材P152）加入试剂。摇匀，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷却，加蒸馏水定容至20ml。以1号管作为空白调零点，在540nm波长下比色测定。以麦芽糖含量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线. * 2、酶液制备：称取1.0g萌发3天的小麦种子（芽长约1-1.5cm），置于研钵中，加少量石英砂和2ml蒸馏水，研磨成匀浆。将匀浆倒入离心管中，用6ml蒸馏水分次将残渣洗入离心管。提取液在室温下放置提取15～20min，每隔数min搅动1次，使其充分提取。然后在3000rpm下离心10min，将上清液倒入50ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶原液。吸取上述淀粉酶原液5ml，放入50ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，即为淀粉酶稀释液。 * 3、酶活力的测定：取6支干净的具塞刻度试管，编号，按表（教材P152）进行操作。 摇匀，置沸水浴中5min,取出后冷却，加蒸馏水至20ml,摇匀，在540nm波长下比色。 * 4、结果计算 淀粉酶活力=C×VT/(W×Vs×t)(mg/g/min) C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）； VT为淀粉酶原液总体积（ml）； Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）； W为样品重量（g）； t为反应时间（min）。 * 五 实验思考 P153 ：1、3 下周实验：实验44 植物组织中丙二醛含量的测定 *