蛋白酪氨酸磷酸酶SHP-1抑制剂筛选模型的构建和应用.pdfVIP

The Establishment and Application of Screening Model for Protein Tyrosine Phosphatase Inhibitor A Dissertation Submitted to the Graduate School of Henan University in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Master of Medicine By Li Xiaoting Supervisor: Prof. Pang Xiaobin May,2013 3 4 摘 要 蛋白质酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatases, PTPs ）是细胞信号转导中的重 要调节因子，与人类疾病密切相关。SHP-1 是含有SH2 结构域的具有高度保守序列的蛋 白质酪氨酸磷酸酶的亚家族中的重要成员，研究表明，PTPs 与糖尿病患者血糖控制以 及糖尿病血管并发症关系密切。寻找蛋白酪氨酸磷酸酶的高活性抑制剂对糖尿病和肥胖 症治疗有着广阔的应用前景。 本课题我们从人脑组织中获取mRNA ，通过RT-PCR 扩增出目标cDNA，构建蛋白 酪氨酸磷酸酶SHP-1-pEASY-E1 重组质粒。将重组质粒转化进E.coli TOP10 感受态细胞 中，筛选阳性克隆进行验证，将测序正确的质粒转化到E.coli Transetta 感受态细胞中表 达SHP-1，获得具有生物活性的体外重组SHP-1 蛋白。同时对表达条件进行了优化，结 果表明20 ℃，0.4 mmol/L IPTG 对表达菌株进行诱导时，SHP-1 在体外高效稳定的表达。 采用我们体外表达获得的蛋白建立 SHP-1 高通量筛选模型，对多种化合物用 SHP-1 抑 制剂筛选模型进行筛选，寻找高活性的蛋白酪氨酸磷酸酶的抑制剂，结果获得活性化合 物J11310 。 实验中以人肝癌细胞株HepG2 细胞和大鼠骨骼肌成肌L6 细胞为研究对象，选用胰 岛素30nM 作为阳性对照对照，评价了 J11310 对细胞糖代谢的影响。结果表明，样品 J11310 对HepG2 细胞和L6 细胞无毒性，可剂量依赖性的促进HepG2 和L6 细胞葡萄糖 消耗，当浓度为1μg/mL 时能显著性促进细胞葡萄糖消耗。提示样品J11310 的作用机制 可能是通过促进肝脏和外周对葡萄糖的利用起到降葡萄糖作用。在 HepG2 细胞中加入 -5 胰岛素，控制样品的有无，以罗格列酮 10 M 为阳性对照，比较细胞葡萄糖消耗量以评 价样品有无胰岛素的协同作用。结果显示，J11310 在HepG2 细胞中有较好的胰岛素协 同性，作用强于罗格列酮，以1μg/mL 作用最强，随着浓度降低，样品对葡萄糖消耗的 -4 -5 协同作用逐渐减弱，在 10 μg/mL，10 μg/mL 时无协同作用。用不同浓度四氧嘧啶对 RINm5F 细胞进行损伤，样品不同浓度的J 11310 均对损伤的胰岛细胞RINm5F 无保护 作用。用细胞免疫荧光方法检测细胞中PGC-1α、Pi-AMPK 、Pi-IRS 的表达量，结果显 示