鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞 smmc-7721抑制作用 邓轶韬1 .doc

鳄胆素联合阿霉素对人肝癌细胞 SMMC-7721 邓轶韬1，丁玉梅，陈清西* （厦门大学生命科学学院，厦门361005；） 摘要 （crocodile choline）（doxorubicin）以不同浓度鳄胆素阿霉素单用药组和联合用药组作用SMMC-7721细胞，MTT法和集落形成实验检测细胞增殖抑制、流式细胞仪分析细胞周期分布、Western blot检测凋亡相关蛋白表达鳄胆素、阿霉素单药与联合均能抑制SMMC-7721细胞的增殖，且呈剂量依赖效应，两药联合有协同效应（P＜0.01）鳄胆素单用药组和阿霉素单用药组的克隆形成率分别为88%30.8%和28.5%，而两药联合后几乎没有克隆形成，表明两药联合有显著的差异．；均能诱导SMMC-7721细胞凋亡，并以联合组，细胞中Bax表达诱导细胞凋亡鳄胆素与阿霉素联合人肝癌细胞SMMC-7721 关键词：鳄胆素；阿霉素；联合用药；肝癌；细胞凋亡 中图分类号：Q 356．1 文献标识码：A * 通讯作者：chenqx@xmu.edu.cn （陈清西） 基金项目： 国家自然科学基金委基础科学人才培养基金科研训练及科研能力提高项目(厦门大学)（基金号：No.J1310027）和厦门大学生物学科拔尖计划项目资助． 肝癌在全球范围内是一种发生率和致死率都很高的癌症，随着现代社会的发展，由于水资源污染等造成肝癌的发生率居高不下，在中国的东南沿海一带更是如此[1]肝癌的临床治疗主要是手术、放化疗与中药结合的方法治疗阿霉素是临床常用的化疗药物，也是肝癌的但阿霉素对正常细胞会产生一定的杀伤作用，造成较严重的心脏毒性和骨髓抑制作用，在临床上的应用受到了一定的限制[2][3, 4]，但是通过添加另一种化疗药物来降低阿霉素的用量可能会来给机体其他的伤害，阿霉素与天然药物的联合将可能真正降低化疗药物的副作用．随着中药研究的发展，动物胆汁在医药上的应用愈发受到重视，中国药典已收载的动物胆汁制剂达到．鳄胆汁是由20种以上的胆汁酸、胆汁醇及中性的甾醇类组成[5]，本实验室利用生化方法从暹罗鳄胆汁中分离提取到的有效成分命名为鳄胆素，对胆管癌、肺癌、肝癌等多种肿瘤细胞有良好的抑制作用[6]．本研究探讨鳄胆素、阿霉素单独及联合作用对肝癌SMMC-7721细胞的体外抑制作用，，为药物的临床联合应用提供理论依据和支持． 1． 材料与方法 材料 鳄胆素由本实验室从暹罗鳄胆汁中提取分离，用100% DMSO溶解，-20 ℃保存，实验时稀释，DMSO终浓度＜1%；阿霉素购自上海生工生物工程有限公司；RPMI-1640培养基购自Invitrogen公司；胎牛血清购自Hyclone公司； MTT购自Sigma公司；人肝癌SMMC-7721细胞由厦门华侨亚热带植物引种园惠赠 实验方法 细胞培养及分组 人肝癌SMMC-7721细胞培养在内含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素和链霉素）的RPMI-1640培养基（pH 72）37 ℃，体积分数为5% CO2培养，取对数生长期细胞用于实验．根据对细胞处理的药物种类及浓度进行分组，对照组鳄胆素、阿霉素单独用药组和鳄胆素、阿霉素联合用药组．鳄胆素单独用药组的终浓度依次为5、10、15、20 μg/mL；阿霉素单独用药组的终浓度依次为01、02、04、08和1.0 μg/mL;联合组用药组的最终浓度依次为：阿霉素（02、04、08和1.0 μg/mL）+鳄胆素（5 μg/mL阿霉素（02、04、08和1.0 μg/mL）+鳄胆素(10 μg/mL)和阿霉素（02、04、08、10 μg/mL）+鳄胆素（15 μg/mL）． MTT法测定鳄胆素和阿霉素单独或联合作用对SMMC-7721细胞增殖的影响 用MTT法测定鳄胆素单药组、阿霉素单药组和两药联合组对SMMC-7721细胞的抑制率．对数生长期的细胞以6×103/孔密度接种于96孔板，每个浓度设置4个重复，每孔加入200 μL，置于CO2培养箱中培养后分别加入μL不同浓度的药液，对照组加入相同体积的DMSO，继续培养24 h后加入20 μ MTT溶液（5mg/mL），培养4 h，弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），37 ℃充分溶解后，用酶标仪测定吸光度，测定波长为490 nm．按下式计算抑制率：抑制率（%）=（对照组OD值－实验组OD值）/对照组OD值×100% 药物联合作用评价 采用金氏公式｛q=Eab/(Ea+Eb)-Ea×Eb｝判断两药不同药物浓度相互作用是否具有协同作用，式中Eab为合用药物的抑制率，Ea、Eb分别为药、药单独用药的抑制率．若q值在085～115内为两药合用单纯相加，q值＞115为有协同作用，q值＜085则表示两药合用有拮抗作用． 集落形成实验 取对数生长期的SMMC-7721细胞，