疏水作用层析原理.pdfVIP

苏州市海崴生物科技有限公司 Suzhou Haiwei Bioscience Co.,Ltd 疏水作用层析原理 疏水作用层析（Hydrophobic Interaction Chromatography ， HIC ）是用适度疏水性的固定相，以含盐 水溶液作为流动相分离生物大分子的液相层析方法，它利用蛋白质表面的疏水部位和固定相上的疏水 基团的结合来达到纯化蛋白质的目的，是蛋白质分离的常用手段之一。 疏水作用层析具有许多的优点：1 ）活性回收率高。用中性或接近中性的盐水体系作为流动相，使 得在酸性及有机溶剂条件下易失活的蛋白质，能以活性状态在疏水层析上进行分离，失活少。2 ）因采 用了盐的水溶液作为流动相，可以在相似条件下进行使许多需要保持生物活性的蛋白质的理化性质研 究，如测定蛋白质的盐析浓度、研究溶液中蛋白质的构象变化行为等。3 ）流动相成本低，大大减少了 反相层析中使用的有机溶剂对环境的污染。 1、原理 疏水作用在生物系统中广泛存在。蛋白质分子是一个外部有一亲水层包围、内部有疏水核的具有 一定空间的复杂体系，其表面亲水性很强，但也有一些非极性的疏水基团或疏水区域，同时还存在较 多的疏水基团裂隙。如果将蛋白质表面的疏水基团暴露于高疏水性的环境里，就可以和固定相上的疏 水基团结合。疏水作用层析就是依据生物大分子疏水性的差异实现分离的。 在高盐环境下，蛋白质表面的疏水区域暴露，这样它的疏水部分即可与含疏水表面基团的固定相 发生较强的疏水相互作用，从而被结合在固定相表面。而一旦降低流动相的盐浓度，蛋白质表面疏水 区域闭合，疏水作用降低，这样就可以实现蛋白质的洗脱。下图为疏水吸附过程示意图。 地址：苏州市相城区阳澄湖镇东横港街9 号 TEL：0512 1 / 3 ADD ：No.9 Donghenggang Road Yangcheng lake Suzhou FAX：0512 Jiangsu P.R. China 苏州市海崴生物科技有限公司 Suzhou Haiwei Bioscience Co.,Ltd 图 1、疏水吸附示意图 目前对蛋白质在疏水层析上是如何与配基和溶剂作用以及配体、蛋白质以什么形态存在等许多问 题并不十分清楚，但蛋白质在疏水层析上的作用机理的研究取得了很大的进展。有许多人提出了不同 的保留模型，这些模型都可以在一定程度上描述蛋白质在疏水层析上的保留行为。主要的理论模型有 疏溶剂化理论和熵增原理。 2、影响疏水层析的因素 在进行疏水作用层析的分离过程优化时，主要影响因素主要包括：基质类型、配体类型和取代度、 盐浓度和盐的类型、pH 等。 基质的类型基本与凝胶层析和离子交换的基质相同。琼脂糖为基质的介质是目前生物分离中应用 最广泛、数量最多的介质，其中交联和改性起了很大作用。疏水配基是疏水层析的固定相上最重要的 部分，是选择层析条件时首要考虑的问题。常见的疏水配基主要是烷烃基和芳香基。对于烷基配基， 烷烃的链长决定了介质疏水性的强弱，一般来说烃链越长，疏水性越强，吸附能力也越强。芳香配基 则比较复杂，即具有疏水作用，又因为苯环的共轭结构，表现为混合模式的分离行为。常用的疏水介 质类型主要可选用苯基-琼脂糖、丁基-琼脂糖和辛基琼脂糖疏水作用层析介质。 地址：苏州市相城区阳澄湖镇东横港街9 号 TEL：0512 2 / 3 ADD ：No.9 Donghenggang Road Yangcheng lake Suzhou FAX：0512 Jiangsu P.R. China