研究报告 一、前言 细胞会藉由一些防御机转来保护自身免于病毒的 .docVIP

研究報告前言細胞會藉由一些防禦機轉來保護自身免於病毒的侵入，而干擾素（interferon，INF）與antiviral effect、antiproliferation及immunomodulatory properties很有關係。INF主要有2種type，type Ι的INF包含INF-α、INF-β、INF-ω；type ??即為INF-γ。其中，細胞被病毒入侵後，會刺激細胞內type Ι INF（INF-α/β）的生成，因此type Ι INF又被稱為viral INF，大多數的細胞皆可製造INF-α/β；而type ?? INF（INF-γ）只有細胞在mitogenic或antigenic的情況下才會被活化，又稱為immune INF，因此也只有免疫系統的細胞才會製造，如自然殺手細胞、CD4 Th1細胞及CD8 cytotoxic supressor細胞。 病毒藉由與細胞表面特定受器接和進入細胞的過程中，會活化NF-κB、ATF-2/c-Jun、interferon regulatory factors（IRFs）及INF-α/β本身，進而刺激INF大量生成。INF可活化下游抑制病毒（antiviral effect）dsRNA生成的蛋白質，如protein kinase (PKR)、2’-5’-oligoadenylate synthase (OAS)、RNase L及Mx protein GTPase，以對RNA病毒的複製程序進行阻礙。而對某些DNA病毒而言，因為病毒本身不產生dsRNA，因此，INF對此類病毒有另外一套的抑制機制，進而保護自身及周遭健康細胞免於病毒的殘害。 由INF所架構的防禦機轉，確實替細胞逐出一道最佳防線，但是在基因治療的策略中，卻顯絆腳。不管在短期或長期，體內或體外的實驗中，轉殖基因的表現確實會受到這些細胞激素（cytokines），如INF、TNF-α、IL的影響，其中絕大多數是負面的效果。文獻指出，cytokines並非以促使受感染細胞本身蛋白質表現異常、引起細胞凋亡機制，或採分解這些外來基因、阻止病毒進入等方式來抑制轉殖基因的表現，而是透過調控啟動子的活性以降低病毒基因（轉殖基因）轉錄形成RNA的過程。已有許多文獻指出，這些cytokines具有抑制CMV啟動子的機制，其中INF-α藉由降低NF-κB的活性而抑制CMV啟動子。 已有許多研究團隊針對桿狀病毒是否誘發哺乳動物細胞產生免疫機制進行詳盡的分析一部份學者認為，病毒套膜上的gp64及gp67與細胞結合後，會刺激細胞的免疫反應；也有學者提出是病毒DNA在內化的過程中與Toll-like receptor 9（TLR9）作用而引起免疫反應。儘管說法不一，但卻證實桿狀病毒確實會引起哺乳動物細胞產生cytokies，如interforn α/β、TNF-α、IL-1α、IL-β、IL-6及IL-12等，這些cytokines是免疫發炎啟動初期的重要訊號傳遞物質。在本研究中以CMV作為啟動子，如前所述，cytokines對CMV具有嚴重的影響；此外，在添加丁酸鈉鹽後，確實可有效提高桿狀病毒的轉導效率，正說明了轉殖基因可能病毒轉導後所誘發的反應抑制。在研究中，將針對細胞經病毒轉導後是否活化此類cytokines，阻礙初期轉導及重複轉導中轉殖基因表現效率。材料與方法：桿狀病毒之放大與純化 昆蟲細胞及培養基 在本研究中，昆蟲細胞Spodoptera frugiperda僅用於重組桿狀病毒的放大及病毒PFU值plaque-forming units)。細胞培養期間，以添加10%胎牛血清（FBS，Invritogen）之TNM-FH（Sigma）作為其培養基並培養於中，置於27 oC，5%CO2之恆溫培養箱中。重組桿狀病毒之建構 此研究所用之桿狀病毒由實驗室所建構完成。簡言之，病毒載體乃由市售之pFastBac-DUAL質體為架構，(a combination of chicken beta-actin promoter and cytomegalovirus immediate-early enhancer)之後， 3. 桿狀病毒之放大我們將加入multiplicity of infection（MOI，定義為pfu/cell，其中pfu指的是plaque forming units，為測量病毒感染力的單位）為0.01之桿狀病毒。感染3～4天之後，觀察細胞的存活率。因桿狀病毒會使昆蟲細胞產生溶裂而將衍生之病毒子代釋放於培養基中，當細胞存活率達60-70%時，收集溶液並以4000 rpm離心10分鐘以去除細胞及細胞碎片。forming assay以定義其病毒有效價數。純化後的病毒分管保存於4 oC中備用。 細胞來源與病毒轉導策略 軟骨細胞的取得與