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大学生科技创新项目 申 报 书 创新项目名称： 基于E-cad/N-cad的表达探讨华蟾素对 乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间质转化（EMT）的影响 创新项目负责人： 许雷来 学校名称： 浙江中医药大学 申报日期： 2015年1月11日 项目类别：个人项目□ 团队项目( 浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划实施办公室 制填写说明 一、申报书要按照要求，逐项认真填写，填写内容必须实事求是，表达明确严谨。 二、格式要求：申报书中各项内容以Word文档格式填写，表格中的字体为小四号仿宋体，1.5倍行距；表格空间不足的，可以扩展或另附纸张；均用A4纸双面打印，于左侧装订成册。 三、申报书由所在学校领导审查、签署意见并加盖公章后，一式1份（原件），报送浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划实施办公室。 二、主要内容 本项目在华蟾素抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭的基础上，以不同浓度华蟾素溶液作用于MDA-MB-231细胞后，通过qRT-PCR检测EMT相关基因E-cad、N-cad的mRNA，Western blot法检测E-cad、N-cad蛋白的表达水平，检测结果通过统计学处理后讨论得出华蟾素对乳腺癌MDA-MB-231细胞上皮间充质转化（EMT）的影响。 具体操作步骤 细胞培养 细胞复苏 将冻存细胞从液氮容器中取出，直接放入37℃温水中快速摇动使其尽快融化，用酒精棉球擦拭冻存管表面，打开盖子，管口过火消毒，用移液枪将细胞悬液吸取至无菌离心管中，再加入5 ml新鲜培养液后混匀离心；1000 rpm离心5 min后，弃去上清液，加入适当含10% 胎牛血清的培养液，轻轻吹打均匀后将其加入100 ml培养瓶中，置37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养。隔天更换新鲜培养液，视情况进行传代。 细胞换液 首先吸除原培养瓶中的旧培养液，每个培养瓶中加入2 ml～3 ml PBS漂洗1次，弃去PBS，之后加入新鲜培养液5 ml，置于37℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中继续培养。 细胞传代 当细胞密度长到可以铺满80～90% 培养瓶时，选取对数生长期生长良好的细胞，弃去原培养瓶中的旧培养液，加入2 ml～3 ml PBS洗涤两次，之后弃去PBS，加入1 ml 0.25%的胰酶，置37℃、5% CO2培养箱中消化，置显微镜下观察，当观察到细胞间隙变大，贴壁细胞突起皱缩时，用手轻拍培养瓶壁，观察直到细胞完全从壁上脱落为止，立刻加入含10%胎牛血清的培养液（MDA-MB-231细胞用DMEM培养液）终止消化作用，用无菌巴氏吸管轻柔吹打细胞成细胞悬液 之后将细胞悬液移至10 ml离心管1000rpm转，离心5 min，弃上清，加入新鲜培养液，移至2～3个无菌培养瓶中，每瓶再补充适量培养液，置37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中继续培养。 细胞冻存 选取对数期生长良好的细胞，用PBS漂洗2～3遍，将培养瓶中加入0.25%的胰蛋白酶置培养箱中消化，加入含10% 胎牛血清的培养液（MDA-MB-231 细胞用DMEM 培养液）终止消化，用无菌巴氏吸管吹打细胞成细胞悬液之后移入10 ml离心管1000rpm转，离心5min，弃去上清液加入1ml 4℃预冷的冻存液（DMSO:胎牛血清=1:9 制成），吹打均匀后移入冻存管，封口标记后先4℃冰箱放置 30 min，-20℃冰箱放置45 min，之后放入-80℃超低温冰箱过夜，次日移入液氮中保存并做好记录。一个月内使用的细胞保存于-80℃中，长期保存的放在液氮中保存。 华蟾素对乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响 2.1 MTT实验检测细胞增殖抑制率 取对数生长期的人乳腺癌MDA-MB-231细胞，用含10％胎牛血清的培养液配成单细胞悬液，计数，按每孔100μl含7000个细胞接种至96孔细胞培养板，每4孔为一组。在37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养使细胞贴壁。培养24 h之后，吸弃每孔培养液，换新鲜含10%小牛血清培养液。加药处理后48h、72h分别向96孔板每孔中加入5 mg/ml 的MTT溶液15μl。将培养板在 37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱中孵育4h后仔细地吸去上清，之后每孔加入150μl DMSO，在震荡器上轻轻震荡，使结晶完全溶解，30 min后用酶标仪在570 nm波长处测吸光度值(OD570)。计算细胞存活率%=实验组OD570值/对照组OD570值×100%。 2