动物细胞的冷冻保存-生物资源保存及研究中心.PDF

動物細胞的冷凍保存 翻譯自:ATCC connection (2004) 24(2):10-11 翻譯者:陳欣怡/生資中心 助理技師 審譯者:黃效民/生資中心 資深研究員 大多數的細胞若無特別的要求，都可冷凍保存於-130°C 以下長達 多年。正確的冷凍保存步驟和方式要比投資於設備及試劑重要多了， 例如建立安全庫存（safety stock ）, 保存繼代數低的細胞，防止細胞 特性的改變，及提供和使用標準的試劑以供連貫性的實驗。 概觀: 當含細胞之懸浮液的溫度低於凝固點時，冰晶會開始形成而溶質 的濃度也相對的增加，如果細胞內的水分可以在降溫過程中滲透出 來，則細胞內的冰將會減少，緩慢的冷卻速度，大致是以每分鐘降 1 °C ，可使細胞內的水分更容易在降溫過程中滲透出來；然而，細胞體 積會因流失水分而縮小，若縮到一定程度以下，則細胞會很快的失去 生存能力。添加冷凍保護劑如甘油或DMSO 則可減緩此現象。 標準的冷凍保存細胞程序是將細胞置於加有冷凍保護劑的培養 基中，緩慢的冷凍細胞直到溫度低於-70°C 。之後，再將冷凍管移至 液氮槽中以維持低於-130°C 的溫度。 解凍細胞則是非常簡單直接:將含細胞冷凍管由液氮槽中取出，立 刻在37°C 的水浴槽中快速解凍，移入無菌操作台內直接加入生長培 養基稀釋培養或溫和的離心去除冷凍培養基，再種入加有完整生長培 養基的培養瓶中培養。 有很多的因素會影響解凍後細胞的存活率，不同的細胞株可能需 部分修改冷凍保存的步驟和方法以提高細胞解凍後的存活率。 某些 關鍵的要素可提供較佳的存活率，例如冷凍培養基的組成，細胞生長 期(growth phase) ，細胞週期(cell cycle)狀態以及冷凍培養基中的細胞 數和細胞濃度。 冷凍培養基 5%至10%的甘油或DMSO(dimethy sulphoxide)是最常用的冷凍保 護劑，雖然DMSO 對細胞有毒性，但卻比甘油能更快穿透細胞且結 果的再現性較佳，然不幸的是，DMSO 會造成某些細胞的分化(如 HL-60 ，前骨髓母細胞) ，以及對一些細胞毒性太強(HBE4-E6/E7 ，肺 表皮細胞) ，此時以使用甘油較佳。甘油可以高溫滅菌，而DMSO 則 必須以過濾方式除菌，在使用DMSO 時要格外小心，因為它可快速 穿透接觸的皮膚，而將有毒物質也一起帶入體內。 特別需注意的是，必須使用試劑級( 或更高級，如細胞培養等級) 的DMSO 或甘油，開瓶後需分裝儲存且避光。ATCC 有提供細胞培 養等級的DMSO (Cat#:4-X) ，而且是經過測試以確保其無毒性。對於 使用無血清培養的細胞，應添加50%的條件培養基 (conditioned medium ，以無血清培養基培養細胞24 小時後回收的培養液)到冷凍培 養基及解凍培養基，以增加細胞解凍後的存活。添加 10 到20%細胞 培養等級的牛血清蛋白(BSA, bovine serum albumin)至無血清冷凍培 養基也可提升冷凍後的存活。 其他的冷凍培養基配方，則包括了高濃度血清(如90%血清) ，以 提供額外的生長激素和冷凍保護作用，另外使用低溫設計配方的 balanced salt solution ，或抑制細胞凋亡作用的添加劑可延緩解凍細胞 的死亡。對每一株特定的細胞最適合的配方，必須實際實驗測試。 設備 冷凍管 關於冷凍管的材質有兩種選擇：玻璃或塑膠。玻璃管較麻煩，需 要先滅菌才能使用，且無標籤，在封管時須使用火焰將管口熔融密 封，若不慎掉落容易破裂，也不易開管。然而，玻璃管能保存較久且 若密封完全可視為零故障的保存方式。ATCC 將細胞株的種子細胞保 存於玻璃管，而分讓細胞則保存於塑膠管。 塑膠管有兩種樣式：一種是內螺紋含矽膠墊圈，另一種則是外螺 紋的。剛開始市場上僅有內螺紋塑膠管，可是卻比外螺紋塑膠管擁有 一些不利的條件，舉例來說，矽膠墊圈雖提供了很好的封口，但蓋子 需要轉的剛剛好緊，太緊或太鬆都會滲漏。 可控速降溫機Controlled-rate freezer chambers 有很多方法可達到一分鐘降 1°C 的降溫速率，其中最好的方式應 該是使用以電腦控制的可程式降溫機(e.g., CryoMed Freeze) ，ATCC 就是使用此方