微生物的遗传和变异-第三节.ppt

以革兰氏阳性的肺炎链球菌为材料，其转化过程大体是： 1、双链DNA片段与感受态受体菌的细胞表面特定位点结合。 2、在位点上的DNA发生酶促分解，形成平均分子量为（4~5) x 106D的DNA片段。 3、 DNA双链中的一条单链逐步降解，同时，另一条单链逐步进入细胞。 4、 转化DNA单链与受体菌染色体组上的同源区段配对，接着受体染色体组的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA所交换和取代，于是形成了杂种DNA区段。 5、受体菌染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一类似供体菌，另一类似受体菌。当细胞分裂后，此染色体分离形成了一个转化子。 转化全过程 转化整合过程 第三节 基因克隆及重组DNA技术 PCR的基本反应体系 （以DNA为模板的反应： 10×缓冲液 　 10 ?l 4种dNTP混合物 　 各200 ?mol/L引物 　　　　 　 各10～100 pmol　模板DNA 　　　 　 0.1～2 ?g　Taq DNA聚合酶 　 2.5 u　Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L加双或三蒸水至 　 100 ?l  Taq DNA聚合酶 来自水生栖热菌 Thermus aquaticus 良好的耐热性 Mg2+依赖性 无校正功能 第四节 菌种的复壮及保藏 几种常用菌种保藏方法的比较 接合 (conjugation)： 细胞与细胞的直接接触（由F因子介导） 转导(transduction)： 由噬菌体介导 自然遗传转化(natural genetic transformation)： 游离DNA分子 + 感受态细胞 利用DNA体外重组技术，将一个特定的基因或 DNA序列插入一个载体DNA分子上，导入宿主 细胞内，使其扩增和表达。 基因克隆 是指对遗传信息的分子操作和施工，即把分离到的或 合成的基因经过改造，插入载体中，导入宿主细胞内， 使其扩增和表达，从而获得大量基因产物，或者令生 物表现出新的性状。 基因工程（genetic engineering）或 重组DNA技术(recombinant DNA technology) 二十世纪生物科学具有划时代意义的巨大事件，推动了 生物科学的迅猛发展，并带动了生物技术产业的兴起。 微生物在基因工程的兴起和发展过程中起着 不可替代的作用！ “微生物与基因工程” 一、基因工程的基本过程 1. 基因分离： a）分别提取供体DNA和载体DNA 2. 体外重组 b）用专一性很强的限制性核酸内切酶分别切割供体和载体DNA 在DNA连接酶的作用下使具有相同粘性末端的供体DNA片段和 载体连接，成为重组载体。 3. 重组载体的传递与筛选 用人工转化的方法将重组载体导入受体细胞中，并通过一定 的筛选标记筛选得到含有目的外源片段的重组子. 4. 在特定的宿主中表达,得到基因工程产品 大肠杆菌生产胰岛素 假单胞菌生产毒素蛋白 二、基因工程的发展历史 对基因工程的建立与发展具有重要意义的几项关键技术： DNA的特异切割 DNA的分子克隆（人工转化方法的建立） DNA的快速测序 聚合酶链式反应（PCR）（DNA的体外扩增） DNA合成技术 DNA的定点诱变技术 基因工程工具酶 基因工程所用到的绝大多数工具酶都是从不同微生物 中分离和纯化而获得的 一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease） 能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割 DNA的一类内切酶。简称为限制性酶（restrition enzyme）。 在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的 限制–修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA， 同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。 限制性内切酶 I型：单一多功能(限制-修饰)的酶，不是特异性的切割，所以用处不大。III型：双功能的酶，特异性的切割，用处不大。 II型：分开的核酸内切酶和甲基化酶 (EcoRI, MEcoRI)。特异性的切割，十分有用。识别序列通常由4-8个碱基对组成，具有回文结构。 EcoRI: Escherichia coli RY13, 识别序列:GAATTC CTTAAG BamHI: Bacillus amyloliquefaciens H, 识别序列:GGATCC