细胞谷氨酰胺酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文.docVIP

细胞谷氨酰胺酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 细胞谷氨酰胺酶（glutaminase）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过谷氨酰胺酶和谷氨酸脱氢酶的酶偶联反应系统中氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）谷氨酰胺酶（glutaminase；EC3.5.1.2）是一种氨基酸水解酶（amidohydrolase），将谷氨酰胺脱氨基（deaminating）转化为谷氨酸。其同工酶具有组织特异性：其功能在肝细胞中产生的氨，用于合成尿素；在肾小管上皮细胞中产生的氨通过氨离子分泌，调节肾的酸碱平衡；同时在胶质细胞（glial cell）和肠细胞中也有表达。谷氨酰胺酶在药物和食品工业方面应用广泛，例如调味品的生产和白血病治疗的药物等。基于底物谷氨酰胺在谷氨酰胺酶酶的作用下，转化为谷氨酸和氨气，进而在谷氨酸脱氢酶的催化下，伴随着氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide adenine dinucleotide；NAD＋）转化为还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH），产生的吸光峰值的变化（340nm 波长），来定量分析谷氨酰胺酶的活性。其酶偶联反应系统为： Glutaminase Glutamine + H2O → glutamic acid + NH3 Glutamic dehydrogenase Glutamic acid + NAD＋ → 2-ketoglutarate + NADH + NH3 产品内容 清理液（Reagent A） 120毫升 裂解液（Reagent B） 10毫升 反应液（Reagent C） 4毫升 终止液（Reagent D） 400微升 缓冲液（Reagent E） 40毫升 酶促液（Reagent F） 800微升 底物液（Reagent G） 2毫升 产品说明书 1份 保存方式 保存 裂解液（Reagent B）、 缓冲液（Reagent E）、 酶促液（Reagent F）和 底物液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里； 底物液（Reagent G）避免光照； 终止液（Reagent D）具有腐蚀性，注意操作安全；有效保证6月 用户自备 1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器 15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 细胞刮脱棒：用于细胞脱离 （微型）台式离心机：用于样品操作 培养箱：用于反应孵育 比色皿或96孔板：用于光度分析的容器 分光光度仪或酶标仪：用于光度分析 实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 裂解液（Reagent B）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。 样品准备 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞） 小心加入3毫升 清理液（Reagent A），覆盖生长表面 小心抽去清理液 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化） 加入3毫升 清理液（Reagent A），混匀细胞 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始） 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g 小心抽去上清液 加入500微升 裂解液（Reagent B），充分混匀 转移到预冷的1.5毫升离心管 强力涡旋震荡15秒 置于冰槽里孵育30分钟 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415） 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－30030.1） 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作 测定准备 开启并设定好分光光度仪（温度为℃）：波长340nm，并置零 从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；避免光照 背景对照测定 ℃预处理15分钟后再预冷的的待测样品（20微克蛋白）在℃温度下孵育分钟移取0微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿 加入0微升液（Reagent ） 上下倾倒数次，混匀 在℃温度下孵育分钟加入0微升 在℃温度下孵育分钟 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照 样品测定 待测样品（20微克蛋白）（注意：样品须清澈）在℃温度下孵育分钟移取0微升 缓冲液（Reagent ）到新的比色皿 加入0微升液（Reagent ） 上下倾倒数次，混匀