变形链球菌表面蛋白抗原（PAc）的A区和P区融合共表达、纯化及抗原性研究.pdfVIP

云南大 学 学报 (自然科 学版 )，2008，30 (6)：625～629 CN 53—1045／N IsSN 0258—7971 JournalofYmmanUniversity 变形链球菌表面蛋白抗原 (PAc)的A区和 P区融合共表达、 纯化及抗原性研究 李富祥 一，杜小刚 ，毕保 良，张以芳 ，马 岚 (1．云南农业大学 动物科学技术学院，云南 昆明 650201；2．云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室，云南 昆明 650224； 3．云南农业大学 科技处，云南 昆明 650201；4．云南大学 单克隆抗体工程技术中心，云南 昆明 650091) 摘要 ：变形链球菌(Streptococcusmutans)是引起人类龋齿的主要致病菌 ，其表面蛋 白(PAc)是龋齿疫苗研 究的主要对象．在该研究中，变形链球菌 pac基因的功能A区和P区经 PCR扩增后，以连接链 Gly4SerGly4连 接，并克隆至pET32a质粒中构建成pET32a—A—P重组表达载体，经 IPTG诱导表达后 ，表达产物 A—P重组 蛋白(rA—P蛋白)经饱和硫酸铵沉淀、镍亲和层析、疏水层析 、离子交换层析纯化，其纯度明显提高，可达 96％ 以上．rA—P蛋白再经过肠激酶切除质粒融合标签和经镍亲和层析纯化后，获得 rsA—P目的蛋白，其分子质量 为80ku左右，纯度可达 98％以上．Westernblot结果表明，目的蛋白rsA—P与鼠抗 S．mutansMT8148菌血清 以及鼠抗rsA—P蛋白血清发生较好的免疫反应．因此 ，rsA—P目的蛋白具有PAc的A区和P区抗原性的完整 性 ，为变形链球菌龋齿基因工程亚单位疫苗的研制奠定基础 ． 关键词：变形链球菌；PAc；重组蛋白；龋齿 中图分类号：R392．11 文献标识码：A 文章编号：0258—7971(2008)06—0625—05 变形链球菌(S．mutans)是引起人类龋齿的主要致病菌，其表面蛋白PAc(CellsurfaceDroteinantigell， PAc)又称为表面抗原SA(Surfaceantigen)，Ag工／II，P1，Pag，SpaA，SpaP等，含有 1500～1566个氨基酸 残基 [，分子质量约为 180 210ku．Bradv等 2根据变链菌表面蛋 白的初级结构将其氨基酸序列分为 1 个信号肽区(aal～38)，2个保守区(A区(aa186～464)和P区(aa840～963))，V区(aa679～823)，1个壁跨 区(aal486～1535)和一个跨膜区(aal536～1556)．其中A区富含丙氨酸，含有 82个氨基酸残基的重复 序列，呈a一螺旋状，属于粘附功能区，与唾液糖蛋白具有高度的亲合力；P区富含脯氨酸，表现为高度疏水 性，呈暴露状，形成伸展状态的 』3一片层结构，含有丰富的T，B淋巴细胞粘附表位，其近 N端对人具有很 好的免疫原性[．PAc是致龋变链菌主要的毒力因子之一，在细菌对牙面的初始粘附中起重要作用，并具 有 良好的免疫原性，可诱导机体的保护性免疫应答，且与人心脏组织无交叉反应_4j，克服了变链菌全菌疫 苗与人心肌的共同抗原诱发心脏组织交叉反应抗体而导致心肌损害，诱发风湿性心脏病和风湿性关节炎 的不足．另外 ，PAc还能诱导细胞免疫应答，它能诱导机体单核细胞、齿髓细胞和牙周围膜细胞产生 INF— a，IL一6，IL一8等细胞因子并促进其释放l55j．研究表明用从变链菌培养物中提取的PAc主动免疫和用抗 PAc单抗被动免疫能抵抗变链菌引起的龋齿[ ]．因此，PAc成为龋齿疫苗研究的主要对象 J．目前，PAc 的不同功能区的表达和纯化已有报道 ，但表达量不高，所纯化的重组蛋 白纯度不高，难以得到大量高纯度 的重组蛋白，限制了龋齿基因工程亚单位疫苗的研究．基于PAc的A区和 P区的重要免疫学功能，本研究 * 收稿 日期：2008—03—15 基金项 目：国家发改委生物技术产业化专项基金资助 (计高技[2002]1454号)． 作者简介：李富祥(1979一 )，男 ，云南人，硕士，助理研究员，主要从事微生物与免疫学方面的研究． 通讯作者：马 岚，女，副教授，硕士生导师，主要从事动物细胞工程 、抗体工程技术方面的研究，E—mail：mamilan@vip．sina．eom 626