逆转录病毒载体构建过程中的“LTR”和“Ψ”.docVIP

逆转录病毒载体构建过程中的“LTR”和“Ψ” 　　[摘要]以剖析逆转录病毒载体构建的一道试题为起点，分析了逆转录病毒基因组中“LTR”和“Ψ”的作用，奠定了逆转录病毒载体构建过程中“LTR”和“Ψ”操作要求的理论基础，这是对试题的必要补充，同时有利于学生对逆转录病毒载体构建过程的全面理解。 　　[关键词]LTR；Ψ；逆转录病毒；载体；构建 　　[中图分类号]G633.91 [文献标识码]A [文章编号]1674-6058（2017）05-0107-02 　　南通市2014届高三第一次调研测试第33题以构建病毒载体并培育转基因小鼠为情境，主要考查基因工程和胚胎工程的主干知识，又着力考查学生阅读理解和分析应用的能力，有较好的区分度，充分体现了多维目标考查的价值取向和“源于教材又高于教材”的命题思想，很好地发挥了模拟考试的检测和学习功能，使学生在学会应用所学知识解决新问题的同时又学到了最前沿的科学知识。 　　具体试题：逆转录病毒载体是目前应用较多的动物基因工程载体之一。运用逆转录病毒载体可以将外源基因插入到受体细胞染色体，使外源基因随染色体DNA一起复制和表达。研究发现，逆转录病毒基因组（RNA）的核心部分包括三个基因：gag基因（编码病毒的核心蛋白）、pol基因（编码逆转录酶）、env基因（编码病毒的表面糖蛋白）。位于这些基因的两端有LTR序列（含有启动子、调节基因等），控制着逆转录基因组核心基因的表达及转移。下图是构建逆转录病毒载体及用于培育转基因小鼠的过程。回答下列问题： 　　（1）催化过程①的酶是____。 　　（2）过程②的工具酶有____和____。过程②中，外源基因一定要插入到病毒DNA的LTR序列中的启动子后，其主要目的是____。 　　（3）过程③中，导人病毒蛋白编码基因（gag、pol和env）的目的是____。 　　（4）过程④中，逆转录病毒载体感染的细胞一般选择内细胞团细胞，因为这类细胞能____。此时，早期胚胎处于____期。 　　（5）在胚胎移植前，需要对代孕母鼠进行____处理，使其生殖器官（子宫）适于早期胚胎的植入和正常发育。 　　（6）研究中必须对嵌合小鼠进行筛选，只有能产生____的嵌合小鼠才能将获得的新性状遗传给子代。 　　参考答案：（1）逆转录酶 （2）限制性核酸内切酶（限制酶） DNA连接酶 控制外源基因的表达与转移 （3）合成组成病毒的蛋白质 （4）发育成新个体的各种组织器官囊胚 （5）同期发情 （6）含外源基因配子 　　试题分析：由图中信息可以知道，逆转录病毒载体构建的基本原理是用外源基因替换病毒基因组中的三个核心基因，构成一个有缺陷（不能合成包装蛋白：病毒核心蛋白、逆转录酶、表面糖蛋白）的逆转录病毒DNA，然后导入能合成病毒包装蛋白的受体细胞（即包装细胞），在包装细胞中包装蛋白将外源DNA转录的RNA包装成具有感染能力的逆转录病毒。但试题所给信息相对有限，学生们对逆转录病毒载体构建的理解有一定的障碍。如gag、pol、env这三个基因在包装细胞里是怎样启动表达的？包装蛋白为何不包装gag、pol、env转录的RNA，而包装了外源DNA转录的RNA？这些问题是学生不理解的，影响着学生对逆转录病毒载体构建的全面理解。而要解决这些问题就必须清楚病毒基因组中的“LTR”和“Ψ”的作用及构建逆转录病毒载体时的操作要求。“LTR”、“Ψ”及“gag、pol、env”的位置关系可表示如下： 　　1.逆转录病毒基因组中LTR的作用及构建逆转录病毒载体过程中的操作要求：LTR是长末端重复序列，分为5LTR和3LTR，含有启动子、调节基因等，其主要作用是启动和调控基因的表达。在包装细胞中，包装蛋白包装的是RNA，所以导入受体细胞的外源DNA必须能够转录，即要求导入包装细胞的外源DNA必须带有LTR。包装细胞能成功合成包装蛋白，就需gag、pol、env基因能够成功表达，所以在构建包装细胞的时候，导人的gag、pol、env三个基因也必须带有LTR，否则不能表达，实际操作过程中，导入包装细胞的是5’LTR-gag-pol-env-3LTR。 　　2.逆转录病毒基因组中“Ψ”的作用及构建逆转录病毒载体过程中的操作要求：Ψ序列是包装信号，包装蛋白是通过识别RNA中的Ψ序列才对RNA进行包装的，所以需被包装蛋白包装的RNA一定含有Ψ序列，而不需被包装的RNA一定不能含有Ψ序列。逆转录病毒载体中包装的是外源DNA转录的RNA，而非gag、pol、env转录的RNA。因此，构建包装细胞导入gag、pol、env三个基因时，相应的核酸中一定不能含有Ψ序列，而向包装细胞导入外源基因时，相应的核酸中一定要含有Ψ序列。 　　综上所述，构建包装细胞时，导入的相关基因应是5’LTR-gag-pol