对转FABP基因小鼠脂肪沉积及生长发育标准研究.docVIP

　　对转FABP基因小鼠脂肪沉积及生长发育标准研究 第一章 引 言 1.动物转基因技术的研究进展 目前为止，各国研究人员在鼠、兔、牛、羊、猪、鸡、鱼等动物上都实现了转基因。经过多年的发展，动物转基因技术在实用性、多样性等方面都取得了很大的进步。传统的转基因技术主要有显微注射法、精子载体法、脂质体介导法、电转染法、病毒载体法等。基因打靶技术、体细胞核移植、RNA 干扰等新转基因技术的出现，大大提高了转基因制备的效率，使转基因动物拥有了更广泛的应用前景。显微注射（microinjection）技术是一种精细的实验技术，是通过显微操作系统将外源基因注入受体动物的受精卵内，从而使外源基因整合到受体细胞基因组中。这种方法是由 Gordon 等（1980）发明的，也是制作转基因动物发展最早、使用较为广泛、效果比较稳定的制备方法之一。在 1982 年 Palmiter 等（1982）应用显微注射技术将大鼠的生长激素基因注射到了小鼠的原核中，获得了体型明显大于正常小鼠的超级转基因硕鼠，首次证明了外源基因能在受体中表达，并且能改变动物的性状。在 1985 年 Hammer等（1985）采用显微注射技术将人的生长激素基因转入猪的受精卵内，转基因猪的生长速度和饲料利用率都得到了明显提高，这也是世界上首次报道的转基因猪。 .. 2.FABP 基因的研究进展 肌肉内脂肪含量是影响肉质性状的主要因素。根据近年来的研究表明，肌肉内脂肪含量能够提高肉的嫩度和口感风味（杨烨 2005；Devol DL et al 1988；陈继兰 2004；陈继兰 2005；李建军 2003；Gerbens F et al 1998；Eikelenboom G et al 1994）。肌内脂肪存在于肌外膜、肌束膜上，有时还会存在于肌内膜上。在营养状况良好的情况下，脂肪先在肌肉的大血管周围蓄积，之后按照肌外膜、肌束膜的顺序蓄积脂肪；在营养状况特别好的情况下，肌内膜周围以及其毛细血管上也会开始蓄积脂肪，使肌肉横断面上呈现出大理石状的花纹，是一种特别理想的肉质（-FABP)和睾丸型(T-FABP)（Su AI 等，2004）。其中心脏脂肪酸结合蛋白（heart fatty acid-binding protein ,H-FABP）和脂肪型脂肪酸结合蛋白（adipocyte fatty acid-binding protein , A-FABP）被作为影响猪肌肉脂肪代谢的候选基因（林万华等 2002；曹红鹤等 2002；Gerbens F et al 1998；Gerbens F et al 2001；李桢等 2004）。 .. 第二章 FABP 转基因小鼠模型的建立及鉴定 1.实验材料和方法 显微注射技术是通过显微操作系统将外源基因注入受体动物的受精卵内，从而使外源基因整合到受体细胞基因组中。这种方法是制作转基因动物发展最早、使用较为广泛、效果比较稳定的制备方法之一。Southern blot 是早期鉴定转基因动物的方法，该方法结果明确可靠，但是操作繁琐、工作量大（Hogan B et al, 1986）。另一种较为常见的鉴定方法是斑点杂交，这种方法较为简单，但是当动物体内整合的外源基因与内源性基因有同源性时，容易出现假阳性（Hogan B et al, 1986）。而聚合酶链式反应（PCR）技术使转基因动物的筛选工作大为简化，在分子生物学领域的应用越来越广泛（S)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)诱导母鼠排卵。PMS 模拟卵泡刺激素(FSH)的作用，hCG 模拟黄体生成素(LH)的作用。注射 PMS 的时间与注射 hGG 的时间间隔为 42-48h，一般在注射 hCG 10-13h 后排卵，每只鼠的注射剂量一般为 5-10u。在小鼠排卵后，用颈椎脱臼法处死形成阴道栓的雌鼠，把完整的输卵管和一小段子宫剪下，放置于 PBS 盐溶液中，在解剖镜下找出输卵管的伞部，用带 4号针头的注射器进行冲卵，将受精卵冲出，用透明质酸去除包围着的颗粒细胞后立即将卵子换到新鲜 PBS 溶液内洗涤 3-4 次后即可用于显微注射。 .. 2.结果与讨论 通过显微注射得到8只转A-FABP基因小鼠，五只公鼠，三只母鼠。转A-FABP基因亲代小鼠生长发育情况正常，并且能够正常繁殖后代，目前我们通过近交繁殖，已培育出5代转A-FABP基因小鼠，其中我们使用亲代小鼠、F1代、F2代、F3代小鼠用于实验。各代转A-FABP基因小鼠生长发育情况正常，而且能在其全基因组DNA中检测到转入的外源A-FABP基因，结果表明所转入的A-FABP基因能够在小鼠体内表达并且能够将转入的外源基因遗传给后代。如图2-1 - 图2-4所示。在脂肪组织中雌鼠的表达量高于雄鼠的表达量，也没有明显的差异。在雄鼠心肌组织中A-FABP基因的表达量为