日本落叶松实生苗small RNA测序、microRNA鉴定及其目标基因差异表达研究.docVIP

　　日本落叶松实生苗small RNA测序、microRNA鉴定及其目标基因差异表达研究 第一章 绪论 1.1引言 日本落叶松(Larix leptolepis)属松科(Pinaceae)落叶松亚科(Laricoideae)重要的针叶树种之一，天然分布在北半球温带山区、寒温带的平原及高山气候区，是我国北方中高山地区天然林更新与人工林营建主要造林和重要纸浆材及建筑材树种。选择育种和杂交育种等常规育种技术取得重要进展，但仍不能满足发展林木良种、提高林木产量，增强落叶松林业生产力的重大需求，其主要原因之一就是我国目前在针叶树分子遗传基础理论研究上缺乏重要突破，导致落叶松遗传改良进程缓慢。为尽快提升日本落叶松等重要的针叶树种在分子层次上的理论研究水平，从 miRNA 水平上研究落叶松生长发育过程中分子调控机制成为林木优良品系选育及新品种规模化繁殖的重要基础理论。目前，针叶树中仅火炬松(Pinus taeda)和欧洲云杉(Picea abies)初步开展了 miRNA 的鉴定工作，对 miRNA 及其目标基因在生物功能方面的研究尚属起步阶段。本研究从miRNA 鉴定工作入手，对其目标基因进行计算机预测，研究其与目标基因在落叶松生长发育过程中的表达差异，既丰富了 miRNA 信息，也为林木遗传改良新领域中的基因定向人工改造提供确切信息。 1.1.1研究背景 在动、植物及病毒等生物中发现的一系列小分子 RNA(small RNA，sRNA)，包括microRNA(miRNA)、小干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)和 piRNA(piiRNA 的鉴定、表达及功能研究，揭示了真核生物一种新的基因表达调控方式。miRNAs 是一类新发现的非编码的小分子 RNA，长约 22nt，广泛存在于动植物等真核生物和病毒中。自 1993 年发现第一个 miRNA-lin4 具有调控线虫幼虫发育时间的功能以来[5]，越来越多的研究表明 miRNA 在生物体内发挥着重要作用，其中最突出的是调控生长发育过程以及肿瘤发生过程。大量研究证明，miRNA 在基因表达调控中扮演多种重要角色，是个体生长发育过程中的关键调节环节。然而，在这些不同生物中发现的 miRNA却存在着很大差异。多数动物 miRNA 通过与目标转录物 3prime;非翻译区的多个位点的不完全互补发生作用，并在翻译水平发挥功能。相反，植物 miRNA 和它们的靶位点通常几乎是完全互补的，并且大多数植物 miRNA-mRNA 的相互作用导致互补结合区 miRNA 第 10位和第 11 位核苷酸位置靶 mRNA 的切割。植物 miRNA 显示了与目标 mRNA 近乎完美的互补性，使得通过生物信息学的方法就能找到许多植物 miRNA 的目标基因。 大量研究报道显示，miRNA 是一类重要的植物生长发育调控因子，在植物根、叶、花等器官极性和器官分化过程中都有 miRNA 的参与。在拟南芥中，miR160 通过负调控生长素响应因子(auxinresponsefactors，ARF)ARF10、ARF16 和 ARF17 的表达来控制根冠细胞的形成[6]。miR164 通过剪切目标基因 NAC1 的 mRNA，削弱生长素信号，抑制拟南芥侧根生长[7]。在玉米中，miR172 负调控 GLOSSY15(GL15)基因的表达，从而促进玉米幼叶向成熟叶的转变[8]。Lu 等[9]在火炬松中克隆并鉴定出 38miRNAs，其中 4 个 miRNAs是保守的、7 个属于火炬松特异基因；这 11 个 miRNA 基因预测出 43 个目标基因。miRNA 在植物发育的多个层面上扮演着重要的作用，但我们对 miRNA 在针叶树生长发育中所起的调控作用尚缺乏认识。针叶树基因组数目庞大，落叶松基因组大小超过11010bp，是拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组(1108bp)的 100 倍、毛果杨(Populustrichocarpa)基因组(5108bp)的 20 倍，甚至比人类(Homo sapiens)基因组(3109bp)还大。至今，尚未完成其全基因组的测序工作。因而，落叶松中 miRNA 及其目标基因的功能还未知。在针叶树种整个基因调控网络中 miRNA调控基因的分子机制和其他物种的机制是否有关，需要我们进一步探索证明。 第二章 日本落叶松 2 年生实生苗 sRNA 测序及其 miRNA鉴定 我国是世界落叶松属物种最富集地域，分布有全世界落叶松属 25 个种的 2/3 左右。落叶松具有适应性强、早期速生、成林快、病虫害少、材质优良等特点，是我国北方中高山地区重要的针叶速生造林用材树种[13]。同等立地条件下，日本落叶松(L.leptolepis)生长周期、胸径和树高生长