黄瓜叶片胞间隙病程相关蛋白的诱导、纯化及MALDI-TOF-MS鉴定－作者.PDF

黄瓜叶片胞间隙病程相关蛋白的诱导、纯化及 MALDI-TOF-MS 鉴定  黄瓜叶片胞间隙病程相关蛋白的诱导、纯化及 MALDI-TOF-MS 鉴定 作者:张静 指导老师: 李得孝 李玉红 摘 要: 苯并噻二唑 （BTH）和霜霉菌处理都可系统的诱导黄瓜叶片胞间隙液产生分子量为 27kD 的新蛋白,这种蛋白为抗性相关的病程蛋白。用电洗脱的方法从 BTH 处理的黄瓜叶片胞间隙液 中纯化了分子量为 27kD 的病程相关蛋白(PRs)。通过 MALDI-TOF-MS （基体辅助激光解吸电离飞行时 间质谱）分析，将所得的 PMF(肽指纹图谱)在 NCBInr 蛋白质数据库中比对，发现的 27kD 蛋白是一 种酸性的几丁质酶，说明几丁质酶参与 BTH 诱导黄瓜对霜霉病的抗性。 关键词: 黄瓜霜霉病；BTH；病程相关蛋白；几丁质酶；MALDI-TOF-MS 霜霉病是我国黄瓜栽培上普遍发生的一种严重病害，应用农药虽能减缓霜霉病的发 生及蔓延，但会导致环境污染和农药残留等严重问题，因此研究黄瓜霜霉病的诱导抗性 对于黄瓜病害的防治以及黄瓜的无公害生产具有重要的意义。又由于大部分的 PR 蛋白 都可在细胞间隙中积累，而且霜霉菌菌丝体在细胞间生长，因此对胞间隙 PR 蛋白进行 研究对揭示诱导剂对霜霉病的诱导抗性机制具有重要的意义。 本研究拟对 BTH 诱导的胞间隙蛋白进行纯化和质谱分析，以期确定这个蛋白的种类 和功能，并获知蛋白的部分序列信息，为进一步探讨诱导抗性的分子机理奠定基础。 1.材料和方法 1.1 试验材料及处理 供试的黄瓜品种为长春密刺， 种子在培养箱中 30℃催芽 24h 后播种于装有牛粪和泥 土（1:1）的营养钵中，20~35℃温室内培养，等长到第二真叶展开时,用 0.5mmol/L 的 BTH 处理第 1真叶，在处理后 1、2、4、7d 进行采收。另对 BTH 处理第一真叶 2d 后又整 株接种的幼苗进行采样, 分别剪取接种后 1、2、4、7d 的幼苗的第 1真叶。每个处理 50 株幼苗,重复 3 次。供试菌种从园艺场试验大棚中的黄瓜霜霉病叶片上获得。将采回的 霜霉病叶用清水洗净，刷去叶背面的霉层，于 18~20℃的条件下保湿培养 1d 后,将叶背 面新产生的霉层刷入烧杯中,用无离子水稀释成浓度为 10x 显微镜下每视野含有 10~15 个孢子的悬浮液。 1.2 试验方法 [1]  胞间隙液的提取参见 Wit 等  的方法;胞间隙液蛋白的诱导研究、目的蛋白的分离 及纯度检测均采用 SDS－PAGE 电泳的方法,分离胶浓度为12.5％， 浓缩胶浓度为 3.75％, 电泳结束后用考马斯亮蓝染色;目的蛋白的回收采用电洗脱法;质谱测定采用MALDI-TOF -MS 分析，得到肽段的肽指纹图谱（PMF）。 2.结果与分析 2.1 BTH 处理后黄瓜叶片胞间隙液 SDS电泳图谱变化 电泳结果表明 （图1） ，与水处理的叶片相比(对照)，BTH 处理后产生了一条比较明 显的诱导蛋白带（27kD） 。 2.2 接种病原孢子后黄瓜叶片胞间隙液 SDS电泳图谱变化 电泳结果表明 （图2） ，在接种病原菌后的叶片上，无论是处理还是对照的电泳图谱 1  黄瓜叶片胞间隙病程相关蛋白的诱导、纯化及 MALDI-TOF-MS 鉴定  中，都出现了 27kD 的蛋白。说明所诱导的 27kD 蛋白是黄瓜幼苗表达的且与黄瓜对霜霉 病的病程相关。而且 BTH 处理的叶片蛋白表达量高于对照，说明 BTH 处理能快速启动黄 瓜幼苗对霜霉病的防卫反应。 2.3 病程相关蛋白的纯化 将电泳胶片上的 27kD 的特异蛋白（考马斯亮蓝染色）割下后进行电洗脱，对回收 蛋白进行 SDS电泳，结果见图 3，从图上可以看出 27kD 的目的蛋白已经纯化,只有 一条带。 1 2 3 4 5 M １ ２ ３ ４ M 5 6 7 8 1 2 M 3 2-5 泳道分别为 BTH 处理 1-4 泳 道 分 别 为 BTH