蜂毒肽与基因变构IL-2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化和生物学活性研究.pdfVIP

蜂毒肽与基因变构IL．2融合蛋白在毕赤酵母中的表达、纯化及 生物学活性研究 摘要 115。 筛选多拷贝阳性菌株，甲醇诱导多拷贝阳性菌株表达融合蛋白，分离纯化该融合 蛋白，并进行抗菌及抗肿瘤生物学活性研究。 组载体pPICZaA厂肛肛一2(88Arg，嗡Ala)；通过电转法转化毕赤酵母GSI15；MMH， MDH筛选Mut+表型阳性菌株GSI15；ZeocinTM梯度法及荧光定量PCR法筛选 多拷贝转化酵母菌株。阳性转化子经甲醇持续诱导表达，提取卜-清，SDS．PAGE blot鉴定抗原性及特异性。经硫酸铵分级 及BCA法检测最佳诱导叫‘间，Western 沉淀法、透析法、镍离子亲和层析纯化融合蛋自；液相测定法研究融合蛋白抑菌 活性，CCK一8法检测该融合蛋白抗肿瘤活性。 结果 成功构建毕赤酵母阳性转化菌株GSI 及MMH筛选出Mut+型重组菌株GSl 及荧光定量PCR法成功筛选出两株多拷叭转化酵母菌株。SDS—PAGE检测在26 h融合蛋白 kDa左右有明显目的条带，与理论值相符。BCA法测定甲醇诱导120 表达量达到最高浓度814．5 mg／L，远远高于该融合蛋白存原核系统中产量。 Western blot鉴定该融合蛋白具有抗原特异性。经硫酸铵分级沉淀法、透析法、 镍离子亲和层析法获得纯度为99％的目的蛋白，绎浓缩管浓缩获得浓度为432．5 mL。经检测纯化的融合蛋白具有抑制金黄色葡萄球菌和大肠 mg／L的目的蛋白5 杆菌的生长活性，具有较强抑制人卵巢癌细胞SKOV3细胞及Hela的生长增殖的 牛物活性。 结论成功构建毕赤酵母分泌表达重组载休pPICZa 出可以稳定高表达的多拷贝重组菌株，表达产物经纯化，获得具有抑菌活性，抗 的新型抗肿瘤药物奠定基础。 硕士研究生李林(病原生物学) 指导教师 王斌教授 关键词： M—IL-2(SSArg，nSAla)；毕赤酵母；表达；纯化；生物活性 ㈣ll峭IIIIIJll Y2589169 High-level and of offusion expression，purificationstudybtoacuvity Pichia proteinMelittin—IL一2(88Arg，125Ala)inpastoris Abstract Toconstruct offusion Objective expressionsystem proteinmelittin—IL一2(88Arg， obtainthe ofinterest 25Ala)inpichiapastoris，and high—levelexpression protein Then interest the ofit．MethodThe purify protein，and studybioactivity purposegene wasobtained PCR from through te