猪Myostatin基因敲除与转录调控研究.docVIP

　　猪Myostatin基因敲除与转录调控研究 第一篇 文献综述 1 Myostatin 基因的发现及其结构特征 1.1 Myostatin 基因的发现 Myostatin基因是在研究新的哺乳动物TGF-beta;超家族时发现的。根据TGF-beta;超家族成员的高度保守区用变性的寡聚核苷酸作为PCR引物，用小鼠基因组DNA为模板，获得了Myostatin的序列[1]。通过筛查小鼠的骨骼肌文库得到了一个全长的Myostatin cDNA序列，最初命名为 GDF-8。当破坏小鼠的Myostatin基因后会引起肥大和增生进而导致肌肉量的显著增加。在牛上该基因发生自然突变也会伴随发生肌肉量的显著增加。因此，又将其命名为肌肉生长抑制素基因Myostatin。Myostatin基因是目前已知的唯一一个肌肉生长的负调控因子，与肌肉的生长发育密切相关。Myostatin基因编码的Myostatin蛋白序列包含TGF-beta;超家族的所有标志性特点，该蛋白包括一个分泌信号序列、蛋白水解处理位点、含有 9 个半胱氨酸残基的保守型羧基末端区[8]。与其他TGF-beta;超家族成员类似，Myostatin是由信号序列、N-末端前肽区域和一个活性配基的C-末端区域组成的 376 个氨基酸的前体蛋白。在动物体内，Myostatin以潜在复合体的形式进行分泌，其分泌形式与其他TGF-beta;家族成员比较相似，但是与BMP/GDF超家族成员的分泌方式有所不同[9，10，11]。Myostatin活化需要对前体蛋白进行两次蛋白质水解切割。第一步切割通过成对碱性氨基酸蛋白酶家族酶类切除 24 个氨基酸的信号肽[12]；第二步切割是发生在RSRR(Arg-Ser-Arg-Arg)位点的第 240-243 氨基酸处，通过BMP1/ Tolloid金属蛋白酶从第一个氨基酸开始到信号序列的切割，剩下 37640Da的 N-末端区域和12400Da的 C-末端区域，即成熟肽[12]，如图 1、图 2 所示。成熟的Myostatin是一个C-末端由二硫键连接的二聚体，二聚体可与Myostatin基因受体结合，进而发挥其生物活性，并且在人、小鼠、大鼠、猪、家鸡、火鸡和狗上表现为 100%的相似度，表明Myostatin基因在不同动物间的序列是保守的。在C-末端区域，Myostatin序列和TGF-beta;家族内其他成员表现出明显的同源性并且与蛋白GDF-11高度同源。 2 Myostatin 基因的生物学功能 2.1 Myostatin 基因对肌肉发育的影响 Myostatin基因的表达模式表明其在肌肉的发育和功能调节上发挥重要的作用[8]。小鼠在胚胎期的第 9.5 天开始发育体节时，Myostatin就在生肌节间隔表达，直至整个胚胎期骨骼肌发育完全。在成年组织中，虽然在脂肪组织中也可以确定能检测到Myostatin mRNA的微量表达，但是Myostatin主要还是在骨骼肌内表达。Myostatin对肌肉发育的影响最初是通过小鼠体内的基因打靶实验得以阐明的[8]。缺失Myostatin蛋白部分C-末端区域的小鼠表现出骨骼肌数量的显著增加，个体肌肉增加的数量是野生型小鼠的两倍(图 3a)。纯合突变小鼠肌肉组织的切片分析表明这些增加是肌纤维数量增加（增生）和纤维大小增加（肥大）联合作用导致的。实验表明动物体各处骨骼肌都受到了突变的影响，并且雌鼠和雄鼠均成比例增加。Myostatin缺失小鼠内肌肉的增加发生在肌肉发育的早期并且持续整个生命过程[13]。值得注意的是，杂合子小鼠也会受到影响，只是受影响的程度低一些，杂合小鼠肌肉的增加量大约比野生型小鼠多 25%，这说明Myostatin的作用是剂量依赖性的。 第二篇 研究内容 第一章Myostatin 基因敲除猪的建立 基因打靶是利用同源重组的方法改变内源基因的技术。它可以按照人们的意愿对哺乳动物基因进行精确的改造，从而改变基因的结构以及遗传特征。目前，已经发展了多种基因打靶的策略，为家畜遗传改良、人类疾病动物模型的建立和基因治疗打下基础。基因敲除依据基因打靶的原理，对基因进行定点改造，研究那些虽然序列已知但是对于其功能还不了解甚至一无所知的基因，通过与正常个体比较得出正常个体和基因敲除个体之间的差异，进而推断出该基因相应的功能。本实验以猪为研究对象，构建了带有正负双筛选标记和 LoxP 位点的猪 Myostatin 基因打靶载体，利用同源重组的方法定点破坏猪 15 号染色体上的 Myostatin 基因，使其不能正常发挥抑制肌肉生长发育的功能，进而通过体细胞核移植的方法获得 Myostatin 基因缺失猪的模型，为进一步在机体内研究 Myostatin 基因的作用机制奠定基础。 第二章Myostatin 基因敲除猪的鉴定