死活细胞鉴别.docVIP

（一）、死活细胞的鉴别生活细胞近似无色透明，用普通光镜无法观察其形态，需用相差显微镜来观察。染色排除法：组织培养中检查死活细胞最常用的是“染色排除法”这类方法简单但不甚严格，它只能判断细胞的代谢死亡，不反映细胞能否增殖。由于未经过固定、专门染色，所以看不到死活细胞的形态差别。所用染料的分类：一般的生物染料不能穿过活细胞膜只有细胞被固定或细胞膜被破坏，染料才能进入细胞膜。第一类 ：死细胞着色，使死细胞着色的大部分是酸性染料。它们不容易穿透活细胞的质膜，进入胞内，但却能渗透死亡的细胞，使之着色。如①台盼兰（Trypan blue）：0.5-1%的台盼兰，pH7.0-7.2，每毫升细胞悬液加 0.1ml 染液，2分钟后镜检，活细胞没有染上，死细胞全部被染成蓝色。②苯胺兰(Aniline’ black)：0.05%的苯胺黑以 1：10 的量与细胞悬液混匀，1-2 分钟后，死细胞被染成黑色。③伊红 Y：细胞悬液与细胞悬液混喝，2 分钟后死细胞被染成桃红色。等。第二类：活细胞着色，多为碱性染料，如中性红、健那绿、亚甲蓝、甲苯胺蓝等。它们是一些无毒或毒性很小的染料，由于电性吸引而堆积在细胞中某一特定的结构上从而显色，即它们解离后带正电，其中有的染料可与胞内某些结构专一性的结合。①1%结晶紫染色生理1%结晶紫盐水与细胞悬液 1：2 混合，立即镜检，或细胞被染成蓝紫色，而死细胞不着色。属于活细胞染料。活细胞染料无毒，无物理、化学变化，基本上不影响细胞的生命活动。②用呀啶橙染色可以鉴别出细胞固定前的死活状态。丫啶橙是一种与 DNA 和 RNA 都能结合的荧光染料，在兰光或紫外光激发下，DNA 可激发出 530nm 的荧光发射峰，RNA 可激发出 640nm 的荧光发射峰，它与双链 DNA 的结合方式是潜入双链之间，而与单链 DNA 和 RNA 则由静电吸引堆积在磷酸根上。在蓝光的激发下，细胞核发亮绿色荧光，核仁和胞质 RNAPage 9发桔红色荧光。因此，原来的活细胞经固定、染色后细胞核呈亮绿色，核仁和散布在细胞质中的 RNA 呈桔红色，胞质其余部分为淡红褐色。死亡的细胞，因物质发生变形，其核呈暗绿色，胞质整个呈暗绿色。但丫啶橙的阳离子也可以结合在蛋白质、多糖和膜上而发荧光，但由于经过细胞固定抑制了这种结合，从而主要显示出的是 DNA 和 RNA 两种核酸。本次实验即选用活细胞染料健那绿来显示线粒体。（二）细胞核和染色体的染色Giemsa 染色：姬姆萨是常用的染料，可观察核、染色体。醋酸地依红染色：可显示有丝分裂染色体的微细结构，如次缢痕、染色质丝的螺旋化等。该染料同时具有固定和染色的作用，因此也可用来坐快速检查有丝分裂指数。（细胞涂片，0.075 mol 的 KCI 低渗 5-10 分钟，使细胞膨胀，染色体分裂；甲醇固定 10 分钟，空气干燥，滴加 2%醋酸地衣红，染 10-20 分钟后即可观察。（三）细胞器的特殊染色1、内质网的显示早在 1945 年，有人用电子显微镜就观察到了小鼠成纤维细胞的内质网。之后，观察内质网基本是采用电子显微镜。在 80 年代中开始发展了一些活细胞荧光染料，又称“荧光探针”，为显示细胞内的模型结构，包括内质网，提供了新的途径。DiOC6(3):是一种亲脂性的阳离子荧光染料，可选择性的与负电性的膜结构结合。在低浓度时仅能染出线粒体，细胞界限不清，较高浓度时（0.5-2.5μg/ml）内质网染色最佳，而容媒体、高尔基体等均然浅色。2、高尔基体的显示在光镜下观察高尔基体可用景点的固定染色，也可用活细胞荧光染料。由于高尔基参与分泌这一动态过程，对糖蛋白、糖脂进行加工、分选和运输，所以在活细胞中研究其动态和三维结构具有重要的意义。Baker 苏丹黑染色法：可用于组织块、体外培养的单层细胞的染色。染色结果：高尔基体呈黑色囊泡，细胞核呈红色。 Page 10活细胞中高尔基体染色：用荧光探针 NBD-hexanoic ceramide 进行染色。溶酶体的显示：观察溶酶体可以用电子显微镜，也可以采用细胞化学的方法来现实。比如，酸性磷酸酶是溶酶体的标志酶。这部分内容在下学期讲。3、线粒体的显示线粒体（mitochondrin）:是细胞内一个极为重要的细胞器，是细胞内物质氧化磷酸化产生能量的重要结构。线粒体的形态结构和功能定位光镜：多为粒状、杆状、线状。不同的细胞类型，不同的生理状况，其形态大小也有所不同。电镜：是由二层单位膜围成的膜性囊，⑴． 外膜与内膜不连接。⑵． 内膜是皱褶的。⑶． 内膜表面不光化的膜结构向内凹陷，形成嵴。⑷． 嵴上有基体微粒（上面有 ATP 酶，是偶联磷酸化的关键装置）。⑸． 嵴间为基质，含蛋白质、脂类、DNA、RNA 和核蛋白体。有关催化线粒体内各种生命活大过程所需的酶和辅酶，都分布在线粒体的基质中。细胞生命活动