生物分子实验.docVIP

生物分子实验设计报告 实验名称：大肠杆菌染色体DNA的分离及限制性内切酶酶切分析 组员： 实验一、细菌染色体DNA的提取及限制性内切酶酶切 实验原理:1、DNA提取的原理：用裂解液（含去污剂SDS)将细胞壁破环、裂解后用乙醇将DNA沉淀下来。SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白与DNA分离；1ml 菌液置于EP管内，12000r/min离心5min。 (2)弃上清液，将沉淀溶于200ul丙酮，振荡混匀，冰浴 5min，8000r/min离心2min. (3）弃上清液，沉淀溶于500ulTE缓冲液，振荡混匀，以8000r/min离心5min. （4）将沉淀重新悬浮于400ul裂解液，反复吹打混匀；冰浴5min，然后70~75℃温育20min. (5)再加入100ul5mol/lNaCl,以14000r/min离心10min；（去除RNA）上清液加100ul酚-氯仿-异戊醇混合液（25：24：1，体积比），混匀后以8000r/min离心5min。(使组蛋白分离） (6)上清液加2倍体积预冷无水乙醇，以14000r/min离心5min.（溶解DNP，沉淀DNA） (7)DNA沉淀溶于500ul70%乙醇，以10000r/min离心1~2min.（洗涤） (8)DNA沉淀溶于30ulTE缓冲液，置-20℃保存备用。 2、限制性内切酶酶切： (1）-20?℃冰箱中取出实验的样品，让其升至室温。? (2)?限制性酶消化是在特定的缓冲液中进行的。缓冲液以10×浓缩贮存液供应，使用时必须稀释成1×缓冲液。? （3)?反应可以在50?μl总体积中进行。按下表三组依次添加试剂。 试剂 试剂管 BamHI 空白 标准 dd?H2o 34μL 40μL 0 10×缓冲液 5μL 0 0 DNA 10μL（1-3μg） 10μL 0 BamHI 1μL? 0 0 Marker 0 0 50μL （4)?加入所有组分后，盖紧管口，轻弹混匀并在离心机上离心2-3秒钟，将试剂甩至管底。? （5)?37℃保温2h。? （6)?将以上三组分别进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 实验二、DNA的琼脂糖凝胶电泳与紫外法测定核酸浓度 实验原理：1、电泳：琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为支持介质的一种电泳方法，是分离、鉴定和纯化DNA片段最为常用的方法之一。不同的DNA分子片段由于其电荷，分子质量及构型的不同，在电泳时的速度就不同，从而可以区分出不同的区带。 2、紫外法测定核酸浓度：利用DNA和RNA对紫外线有最大吸收波长值的性质，可以测定DNA和RNA的浓度和纯度，双链DNA（50mg/L）在260nm处的吸光率为1,。单链RNA(40mg/L)在260nm处吸光率为1。测定样品在260nm和280nm处的吸光率，如果A260/A280为1.8到2.0，则核酸较纯；A260/A280低于1.6则样品中含有蛋白质，比值越低样品纯度越低。 实验材料：1、电泳：实验一中的三组试剂、电泳缓冲液（0.5倍浓度TBE缓冲液）、溴乙锭溶液、上样缓冲液。 2、紫外法测定核酸浓度：双蒸水 实验器材：1、电泳：电泳槽（带梳子）、透明胶纸、一次性手套、移液器，滴头，紫外检测仪。 2、紫外法测定核酸浓度：紫外光分光光度计、比色皿（1cm) 实验操作： 1、电泳： （1）用TBE缓冲液配制0.8%的琼脂糖，微波炉加热使其熔化，在温度降到50~60℃时加入适量溴乙锭溶液（每100mL琼脂糖加7~8μL）。 （2）取有机玻璃制胶板槽，有透明胶带沿胶槽四周封严，并滴加少量的胶液封好胶带与胶槽之间的缝隙。水平放置胶槽，在一端插好梳子，在槽内缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。 （3）待胶凝固后，小心拔起梳子，撕下透明胶带，使加样孔端置阴极段放进电泳槽内。在电泳槽内加入0.5×TBE电泳缓冲液，至液面覆盖过胶面。 （4）把待检测三组样品与上样缓冲液按六比一混合后，用移液枪加至凝胶的加样孔中。 （5）接通电泳仪和电泳槽，并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过