遗传工程 - 载体.pptVIP

第三章 基因工程载体;基因工程载体的概念;第一节 质粒载体;质粒的空间构型： 质粒空间构型与电泳速率： 同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同，scDNA最快、lDNA次之、ocDNA最慢。;质粒的类型： 在大肠杆菌中的质粒，可以分为： 1、接合型质粒（能自我转移）：除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。如：F质粒（性质粒、或F因子）。甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。不符合基因工程的安全要求。 2、非接合型质粒（不能自我转移）：虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。如R质粒（抗生素抗性质粒）和Col质粒（大肠杆菌素colicin ）。符合基因工程的安全要求。;质粒的复制类型 严紧型质粒（stringent plasmid）：拷贝数少，只有1—3份拷贝。（接合型质粒分子量大，一般属严紧型）。 松弛型质粒（relaxed plasmid）：拷贝数多，有10—60份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。 质粒的不相容性 又称质粒的不亲和性，在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定共存，这一现象称为质粒的不相容性,又称质粒的不亲和性。;质粒的复制过程 质粒的复制主要是通过θ型复制和滚环复制两种方式之一进行的，其中以θ型复制为主。在θ型复制中，有单向半保留复制和双向半保留复制。;滚环复制;复制起点(ori)区的功能 复制起点是一段特定的DNA序列，长约几百碱基对，在其相关的调控元件中含有由质粒或宿主染色体编码的、参与DNA合成起始调控因子的结合位点。 在大多数质粒中，与复制有关的蛋白质基因位于ori序列附近，因此ori位点周围的小范围DNA是质粒复制所必需的。 如果质粒DNA的大部分区域被去掉，而只保留质粒的ori序列，而且质粒是环状的，则质粒仍然能进行复制。 将ori区克隆到一个不能自主复制的环状双链DNA分子上并引入到原核细胞后，该重组DNA具有自主复制能力。分子克隆中常用的质粒载体就是以这种方法构建的，同时用这种方法可以确定哪部分DNA是ori区并研究ori区的功能。 ori区域常决定了质粒的许多特性，如质粒的寄主范围和质粒的拷贝数。;质粒的命名 用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称，再加上质粒编号。如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。;质粒载体的构建 天然质粒的局限性 1、分子量大，拷贝数低，第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，分子长 9.1 kb。但只有一个EcoR I切点充当克隆位点，Tetr 作为筛选标志。EColR I 酶切位点位于Tetr 基因外部，外源基因插入不会引起筛选基因失活，因此无法区别重组体和野生型质粒。 2、天然质粒ColE1质粒，长度为6.3 kb，唯一的EcoRI酶切位点位于筛选标志基因大肠杆菌素E1（colicin E1）内部。colicin E1能杀死不含ColE1 质粒的菌，形成“噬菌斑”。可以通过插入失活筛选。但细菌群体容易自发突变出抗colicin E1的细胞。 质粒载体的发展概况 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量(降低载体长度)，建立多克隆位点区和新的遗传标记基因,如pUC系列载体。 第三阶段：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。;理想质粒载体必须具备的基本条件： 1、具有复制起点（ORI） 2、具有抗菌素抗性基因：是筛选的标志。理想的载体应该有两种抗菌素抗性基因。 3、若干限制性内切酶的单一位点：用来插入外源DNA片断。且插入后不影响复制功能。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。;质粒的选择标记及其工作原理： 抗菌素抗性 绝大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记. 氨苄青霉素抗性（Ampr）:青霉素的衍生物。氨苄青霉素通过干扰细菌细胞壁合成的末端反应，杀死生长的细菌。 Ampr基因编码?-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的?-内酰胺环。 卡那霉素抗性（Kanr） :卡那霉素通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读，从而杀死细菌。Kanr 编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合作用。 四环素抗性（Tetr）:四环素通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀死