彗星法DNA损伤检测试剂盒说明书.PDF

南京建成生物工程研究所 仅用于科研、实验室 彗星法 DNA 损伤检测试剂盒说明书 一、试剂盒说明 DNA 在自由基（如·OH ）的攻击下容易发生损伤，即脱氧戊糖遭到破环，磷酸二脂键的 断裂，碱基的破环或脱落，便可进一步产生单链断裂或双链断裂。将细胞固定于低熔点琼脂糖 中，取少量细胞涂在载玻片上，用碱高盐溶液破坏细胞膜，再用碱溶液使 DNA 分子解旋。将 载玻片置于电泳液中，在电场的作用下，DNA 分子向阳极移动。如果 DNA 损伤严重，碎片多， 则电泳速度快。未受损伤的 DNA 大分子则由于细胞膜的阻隔，滞留在原处。用 PI 染色或银染， 可观察到 DNA 受损的细胞形同彗星现象，作定性分析。也可用相关的软件作定量分析。 二、试剂盒组份 组份 规格：20 assays 储存条件 Lysis Bufffer 100ml 4 ℃ DMSO 8ml 4 ℃ 正常熔点琼脂糖 NMA 30mg 4 ℃ 低熔点琼脂糖 LMA 30mg 4 ℃ Propidium Iodide （PL ） 400 μl 4 ℃避光 三、所需仪器及自备试剂 低速离心机、水平电泳仪、荧光显微镜、37℃和45 ℃恒温水浴箱、载玻片、盖玻片、平皿、 微量移液器、1.5ml Microube、0.4mmol/LTris-HCl （pH7.5 ）缓冲液、PBS 四、注意事项 Propidium Iodide （PI ）和EB 有毒，操作时要戴手套。 五、操作步骤 6 1 、细胞用冰冷的PBS洗一次，离心收集，用PBS重悬使其密度为 1x10 个/mL ； 2 、铺胶：下述各浓度琼脂糖凝胶均用 PBS 配制， 第 1 层凝胶的制备：将载玻片的磨砂面向上，45 ℃预热，将预热 45 ℃的 100 μL 的 0.5% 正常熔点琼脂糖（NMA ）铺于载玻片上，盖上干净的盖玻片，再置4 ℃下 10min使NMA 凝固。 4 第 2 层凝胶的制备：将 10 μL细胞（约 10 个）和 75 μL 的0.7%低溶点琼脂糖LMA （在37℃下水浴加热至少20min 使之完全溶化）混合均匀。然后，轻轻揭去盖玻片，迅 速将含细胞的 LMA 滴到第 1 层琼脂糖上，立即盖上另一干净盖玻片，置 4 ℃10min 使第 2 层 LMA 凝固。 1 南京建成生物工程研究所 仅用于科研、实验室 第 3 层凝胶的制备：第 2 层LMA凝固后，在室温下小心移去盖玻片，滴加预热 37℃的 75 μL 的 0.7%低溶点琼脂糖LMA ，如上盖上盖玻片 4 ℃下凝固（第三层覆盖第二层周围 0.5mm,增加凝胶化作用时间至 30min，高湿度环境）。 3 、细胞裂解 移去盖玻片，将玻片置于平皿中，倒入预冷的 Lysis Bufffer （使用前每9mL 加入 1mL 的DMSO ），4 ℃裂解 1~2h，取出载玻片用PBS 漂洗。 4 、DNA 碱解旋 将载玻片置于水平电泳槽。倒入新配制的碱性电泳缓冲液（用户自备 1mmol/L EDTA，300mmol/L NaOH ），约覆过载玻片胶面0.25cm 左右，室温放置 20~60min, 以便使DNA 在碱性条件下解螺旋和产生碱易