土壤真菌分离计数.docxVIP

兼用于土壤真菌的分离和计数：孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基，成分准确，其上发育的真菌数量及种类较多，放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制，但真菌菌落较小，是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌，与酸性培养基相比，必须转移更多的菌落到其它的培养基上。PDA和MEA均为酸化的天然培养基，能抑制全部细菌和放线菌。但由于酸度过高。有些耐酸性较弱的真菌，在其上不能发育，因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大，放线菌和细菌也全部被抑制，数量准确，但由于结晶紫的影响，不易在培养基上直接鉴定。土壤真菌常用的分离方法：1、稀释法　此种方法在土壤真菌分离中最常用，用无菌水将土壤稀释后得到10-3～10-4的悬浮液，将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上，菌落长成后，将单个菌落挑出、培养、鉴定。这种方法对土壤中产孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus和毛霉属Mucor等有利，所分离到的主要是以孢子形态存在于土壤的真菌，以菌丝体形式存在的则较难分离到。这种方法分离的真菌并不能代表土壤中真菌的真实存在情况，因为部分真菌的孢子和菌丝经常附着在土壤颗粒上，没有被充分洗脱下来，因而也就无法继续培养，这样有可能丢失了很大部分真菌。2、土壤平板法将一定量土壤(一般1.5~5 mg)移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃的培养基，摇匀后培养；或将土壤直接加在冷却后的培养基表面培养。稀释法分离过程中，附着在矿物粒子或埋藏在腐殖质内的真菌不易分离到，此种方法可较全面获得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌还可以分离以菌丝存在的真菌。若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生长过快，会很快覆盖培养皿而不易分离得到其他生长相对慢的真菌，因此该方法对生长较快的真菌有利。3、菌丝分离法　一定量土壤充分冲洗后，过孔径50μm的筛，残留筛上的土粒置于培养皿中，体视镜下观察，将黏附于土粒上的菌丝或菌丝块取出，置于培养皿中，然后倒入培养基培养，将生长的新菌丝顶端切下后再培养，这种方法分离的真菌一般都是前两种方法未分离到的。该方法对以下真菌的分离有利：菌丝较粗；不易断裂；颜色较深。但这种方法获得的分离物在培养过程中，经常作为不育菌丝的形态存在，难以产孢，因此无法鉴定，而且费时、费力，不是很常用。4、诱饵法　这是一种生物学的方法，适合于从土壤中分离数量较少的特定真菌，即将“诱饵”埋入土壤一段时间，取出后直接培养以此获得所需要的真菌。分离的真菌不同，所选用的诱饵也不同，如大麻种子就是分离水生菌以及腐霉属Pythium很好的诱饵；而凤梨的茎和叶子能够诱集Phytophythora cinnamomi；胡萝卜的圆片可以诱集Thielaviopsis basicola；土豆的块茎诱集Phytophthora infestans；喜角质的壶菌常用的诱饵为人的毛发。5、其他的分离方法孢子悬浮法：最初用来分离长蠕孢属Helmithosporium，也适于分离其他以孢子状态存在土壤的真菌。干燥法：通过将土样用氯化钙干燥后，进行分离。该种方法分离获得的是在土壤中以孢子状态存在的真菌，而以菌丝状态存在的真菌则因为干燥失水死亡。埋管法和Rossi-Cholodny埋片法：这两种方法中，生长旺盛、对低氧忍耐较强的真菌比较容易分离到，较易分离以活跃菌丝存在的种类，如立枯丝核菌Rhizocotoniasolani。土壤真菌计数法直接计数法培养后测定菌落数【稀释平板法、土粒法以及最大概率数值法】间接计数法土壤真菌染色后在显微镜下计数【Rossi-Cholodny埋片法、Jones-Mollison法、Thornton-Gray (Ratio)法、土壤切片法、荧光抗体法以及电子显微镜直接观察法、荧光显微镜观察法等】直接计数法稀释平板法根据土壤中真菌的数量，一般采用的稀释度为10-1~10-3，同时称取待测土样10g左右，经105℃烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，计算土壤含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中，重复4次，于28~30℃恒温箱中培养5~7d，选取菌落数在10~100的培养皿进行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂表面15%的培养皿)。最大概率数值法以烟草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsis basicola)为例，取烘箱干燥土样10g。用每毫升含60μg金霉素的灭菌蒸镏水配制每级10倍的稀释液至10-5或10-6。在铺有滤纸的