1 引言 以前的研究表明，松果体素（melatonin）主.docVIP

　　1 引言 以前的研究表明，松果体素（melatonin）主 　　1 引言 　　 　　以前的研究表明，松果体素（melatonin）主要由松果体细胞分泌，它在光照/黑暗（light-dark, L－D）周期下对昼夜节律的调节起着很重要的作用[1, 2]。一般而言，从色氨酸合成松果体素需要一系列的酶促反应。首先，色氨酸从血液循环中被摄取，经过羟化，脱羧，N-乙酰化和氧甲基化，最终形成松果体素。其具体过程如下：色氨酸在色氨酸羟化酶（Tryptophan Hydroxylase, TPH）的作用下羟化为5-羟色氨酸(5-Hydroxytryptophan)。5-羟色氨酸经过芳香氨基酸脱羧酶（Aromatic Amino Acid Decarboxylase）的作用转化为5-羟色胺。5-羟色胺（5-HT）在N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的作用下经过N-乙酰化形成N-乙酰基-5-羟色胺（NAS）。最后通过氧甲基化将N-乙酰基-5-羟色胺（NAS）在羟基吲哚甲基化转移酶（hydroxyindole-O-methyltransferase，HIOMT）的作用下迅速转化为松果体素。合成以后的松果体素并不储存在松果体，而是随即被动地进入血液循环[3]。 　　光照可以抑制松果体素的分泌，而黑暗则可以促进松果体素的分泌。光照在调节哺乳动物松果体素节律的过程中起着重要的作用。并且，视交叉上核（suprachiasmatic nuclei of thehypothalamus，S）是内源性节律产生和调节的主要结构[4]。松果体素节律的产生需要以下几个步骤：眼睛在光照－黑暗（L-D）条件下对光线的感知；视交叉上核（S）中 clock基因的诱导作用；交感神经以节律形式传来的神经冲动传到松果体；夜晚去甲肾上腺素(NE)释放的增多。去甲肾上腺素(NE) 和松果体的alpha;-和beta;-肾上腺素能受体结合，beta;-受体的兴奋活化腺苷酸环化酶导致细胞内的cAMP 迅速增加[5, 6]。cAMP 作为第二信使，可以调节松果体中N-乙酰基转移酶（serotonin N-acetyltransferase, NAT）的活性，最终通过两种方式导致松果体素的合成增加。第一种是通过cAMP 依赖的机制激活N-乙酰基转移酶（NAT）的活性，其中包括mRNA 和蛋白水平的增加；第二种主要是因为cAMP 可以在一定程度上抑制N-乙酰基转移酶（NAT）的失活[7]。N-乙酰基转移酶（NAT）活性的这种节律被认为是松果体素产生节律的主要原因。 （转载自fT）的活性不没有表现出24 小时节律性波动。 　　本采用在持续黑暗的环境下体外培养大鼠的松果体细胞，利用放射免疫分析（RIA）的方法检测大鼠松果体细胞分泌的松果体素水平。目的是为了验证体外培养的大鼠松果体细胞是否具有 circadian clock 可以调节松果体素的节律性产生。plex cosine function（CCF）统计分析结果表明，新生大鼠的松果体细胞产生松果体素的内源性节律在持续黑暗的环境下可以维持大约9 天。上述结果暗示，它可以作为一个有用的体外模型来分析节律系统的生理基础。 　　 　　2 材料与方法 　　 　　2.1 动物和试剂 　　实验中所用的新生（1 天，SD）大鼠购于安徽省实验动物中心。母鼠在20－23℃和12:12 光照/黑暗周期（7：00 开灯，19：00 关灯）环境中饲养。动物饲养，关爱和应用都遵循相关法律规则，并且尽量减轻动物的疼痛。 　　细胞培养基 Dubucco’s modified Eagle’s medium (DMEM) 和胎牛血清（fetal bovineserum, FBS) 购于Gibco 生物公司。缓 冲 液HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid), 谷氨酰胺（L-glutamine）, 青霉素（penicillin）, 链霉素（streptomycin）, 兔抗5－羟色胺（rabbit anti-serotonin）, 胶原酶（collagenase）, 维生素C（Ascorbic acid）购于Sigma-Aldrich 公司。 Melatonin Research RIAkit 购于 Labor Diagnostika Nord (LDN, Germany)公司。 　　2.2 松果体细胞培养 　　按照以前的文献所描述的方法体外培养原代的大鼠松果体细胞[17]。首先取出生1 天的SD 幼鼠，75％乙醇消毒，无菌条件下取出松果体，放入冷D-PBS 溶液中。后用0．25％胰酶和100u/ml 胶原酶消化液37℃消化，20 分钟后用含10％胎牛血