银杏MECT基因启动子克隆及序列分析.docVIP

　　银杏MECT基因启动子克隆及序列分析 袁红慧1，程 华１，李琳玲１，陈小玲１，程水源２ （１．黄冈师范学院生命科学学院，湖北 黄冈 ４３８０００； 2.武汉轻工大学生物与制药工程学院，武汉 430023） 摘要：以前期获得的银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列为模板，通过设计特异性引物及采用染色体步移的方法从银杏基因组中克隆到ＧｂＭＥＣＴ翻译起始位点上游９８２ ｂｐ的启动子序列，研究银杏ＭＥＣＴ基因启动子的结构及功能特点。生物信息学分析结果表明，该启动子序列中含有多种类型的顺式作用元件，主要有典型的光响应调节元件、激素响应调控元件、抗病虫害响应元件ＴＧＴＣＡ序列、抗损伤应答元件ＥＲＦ３和热激响应元件ＨＳＥ等。此外，在该启动子片段中还含有氧胁迫和铜离子响应元件、淀粉酶响应元件等其他类型的作用元件，充分体现了启动子对基因表达调控具有转录水平上的高效性和复杂性的特点。 .. 关键词：银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）；染色体步移；２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸胱氨酰转移酶基因；调控元件 中图分类号：Ｓ７９２．９５ 文献标识码：Ａ ：０４３９－８１１４（２０１５）０７－1746－０5 DOI:10.14088/j.ki.issn0439-8114.2015.07.055 在银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ Ｌ．）萜内酯合成的ＭＥＰ途径中，ＭＥＣＴ （２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ ４－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＭＥＰ ｃｙｔｉｄｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）是其第三步反应的催化酶，催化２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤藓醇－４－磷酸（２－Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ－４－ｏｈｏｓｐｈａｔｅ， ＭＥＰ）形成４－（胞苷５－焦磷酸）－２Ｃ－甲基赤藓糖［４－（ｃｙｔｉｄｉｎｅ ５－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ）－２Ｃ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ｅｒｙｔｈｒｉｔｏｌ，ＣＤＰ－ＭＥ］，并最终形成合成萜内酯的前体物质，因此ＭＥＣＴ是调控萜类物质合成的一个关键酶。目前，已经从银杏（Ｇｉｎｋｇｏ ｂｉｌｏｂａ．Ｌ）［１］、拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）［２］、玉米（Ｚｅａ ｍａｙｓ）［３］、番茄（Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ ｅｓｃｕｌｅｎｔｕｍ）［４］、水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ）［５］、大豆（Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ）［６］、火炬松（Ｐｉｎｕｓ ｔａｅｄａ）［７］等多种植物中克隆了ＭＥＣＴ基因。 研究发现，在ＤＮＡ水平上，银杏ＭＥＣＴ基因与拟南芥和水稻ＭＥＣＴ基因相似度分别达到了７０．７％和７０．２％。尽管已从多种植物中获得ＭＥＣＴ基因的ｃＤＮＡ序列，但目前关于该基因启动子表达调控方面的研究报道较少，尤其缺乏对该基因启动子的基本结构和功能分析方面的探究，本试验通过染色体步移法克隆银杏ＭＥＣＴ基因的启动子，初步分析该启动子所含的调节元件和作用特点，旨在为启动子下一步的功能分析提供可靠依据。 １ 材料与方法 １．１ 试验材料 银杏幼叶采自黄冈师范学院银杏苗圃园，品种为家佛手１４年生实生苗。采后自封袋封装，于－８０ ℃冰箱中冷冻保存。试验所用大肠杆菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）菌株Ｔｏｐ１０为经济林木种质改良与资源综合利用湖北省重点实验室保存。 １．２ 试验试剂 各种限制性内切酶、ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚合酶、ＰＣＲ产物克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ、ｄＮＴＰ、ＤＬ２０００、Ｔ４ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ和Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ均购自大连宝生物工程有限公司；ＤＮＡ回收试剂盒为Ａｘｙｇｅｎ公司产品。各种寡核苷酸序列由上海生物工程有限公司合成。 １．３ 试验方法 １．３．１ 银杏ＤＮＡ提取 采用改良的ＣＴＡＢ法［８］大量提取银杏基因组ＤＮＡ。 １．３．２ 基因组酶切与连接 用平末端限制酶ＥｃｏＲⅤ、ＤｒａⅠ、ＳｓｐⅠ、ＰｖｕⅡ、ＳｔｕⅠ、ＨｐａⅠ、ＳｃａⅠ和ＳｍａⅠ分别进行单酶切，３７ ℃酶切过夜（８ ｈ），各取５ μＬ用０．８％的琼脂糖电泳检测是否酶切完全，酶切产物分别纯化回收；回收后与各自的接头连接，体积为５０ μＬ。连接反应体系为ＤＮＡ酶切产物（模板）３０ μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ （１０×） ５ μＬ、接连体１０ μＬ、Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ３ μＬ、ｄｄＨ２Ｏ ２ μＬ，反应程序为１６ ℃连接１２ ｈ。 １．３．３ 引物设计及染色体步移扩增 根据Ｇｅｎｅｂａｎｋ提交的银杏ＭＥＣＴ基因ｃＤＮＡ序列（登录号ＤＱ１０２３６０）分别设计引物ＭＴ１、ＭＴ２（表１），与２个接头引物ＡＰ１、ＡＰ２形成巢式引物，进行第一次步移扩增。将得到的目的片段连接到ｐＭＤ１８－Ｔ载体上，