前肽缺失体vWF改善FVIII基因断裂转移细胞的重链和活性分泌.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（７）：２０２５ 前肽缺失体 ｖＷＦ改善ＦＶＩＩＩ基因断裂转移 细胞的重链和活性分泌  朱甫祥 　刘泽隆　缪　静　屈慧鸽　迟晓艳 （鲁东大学生命科学学院　烟台　２６４０２５） 摘要　通过转ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子（ｖＷＦ）的前肽缺失突变体（ｖＷＦＰｒｏ）基因，探讨了ｖＷＦＰｒｏ Δ Δ 对双载体转凝血 ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）基因的影响。将 ｖＷＦＰｒｏ基因和 Ｂ区缺失型 ＦＶＩＩＩ（ＢＤＤ Δ ＦＶＩＩＩ）的重、轻链基因共转染ＨＥＫ２９３细胞４８ｈ后，ＥＬＩＳＡ检测重链的分泌量为（１４２±２９）ｎｇ／ｍｌ， 明显高于未转ｖＷＦＰｒｏ基因细胞（８７±１５）ｎｇ／ｍｌ；未转ｖＷＦＰｒｏ基因时单独转重链基因的重链 Δ Δ 分泌水平很低，ｖＷＦＰｒｏ存在时重链分泌量明显提高，但不如共转基因时的重链分泌，提示轻链 Δ 可反式促进重链分泌；单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高，且不受ｖＷＦＰｒｏ Δ 影响；Ｃｏａｔｅｓｔ法检测分泌的凝血活性显示，转ｖＷＦＰｒｏ基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于 Δ 未转ｖＷＦＰｒｏ基因细胞（０．８０±０．１５ＩＵ／ｍｌｖｓ０．４１±０．０８ＩＵ／ｍｌ）。另外，转ｖＷＦＰｒｏ基因条 Δ Δ 件下，合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中，也检测到ＦＶＩＩＩ凝血活性（０．２３±０．０９ ＩＵ／ｍｌ），提示ｖＷＦＰｒｏ有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体。表明转ｖＷＦＰｒｏ基因可 Δ Δ 促进双链转ＦＶＩＩＩ基因，为进一步动物体内实验奠定了基础。 关键词　前肽缺失型ｖｏｎＷｉｌｌｅｂｒａｎｄ因子　凝血ＶＩＩＩ因子　双载体转基因 中图分类号　Ｑ７　Ｒ５５ 　　腺相关病毒（ａｄｅｎｏａｓｓｏｃｉａｔｅｄｖｉｒｕｓ，ＡＡＶ）载体因 ＡＡＶ载体转 ＦＶＩＩＩ基因的靶细胞主要为肝细胞，由于 可介导因子ＩＸ在肝脏和肌肉中的持续表达，被视为转 ｖＷＦ可使促活化的血小板粘附和聚集，其前肽 ［１２］ ＦＶＩＩＩ基因的理想载体 。但ＡＡＶ载体的容量有限。 （ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）缺失突变体（ｖＷＦＰｒｏ）失去此功能，但仍 Δ 运用双载体转ＦＶＩＩＩ重链和轻链基因，表达后链间形成 ［９］ 有结合并稳定ＦＶＩＩＩ的功能 。本文观察了ｖＷＦＰｒｏ Δ 功能性异源二聚体发挥凝血活性，可有效克服ＡＡＶ的 表达细胞对双载体转ＦＶＩＩＩ基因的影响。 ［３４］ 容量限制 。但重链分泌性低下导致重链与轻链分 ［５６］ １　材料与方法 泌量相差１０