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蛋白质复性（二） 本章内容 包含体的形成和性质 包含体的纯化和溶解 稀释复性、辅助因子的作用 分子伴侣和人工分子伴侣 本章重点 蛋白质复性的概念 包含体的概念及性质 蛋白质折叠的简化动力学模型（形成的机理） 包含体体内抑制策略 包含体分离纯化的一般方法和步骤 包含体的溶解方法 稀释复性的原理 蛋白质复性中常用的辅助因子及其作用 1 包含体的分离纯化 从细胞破碎开始，常采用机械破碎、化学裂解、酶解或联用 离心沉降是常用的分离手段 膜分离也可以用于包含体的分离回收 用适宜的缓冲液对包含体进行洗涤 分离纯化注意事项 包含体的纯度对于复性收率影响显著 （包含体的纯度对复性收率的影响？） 对于特定的表达系统和表达产物，需根据具体情况进行纯化过程开发实验，确定适宜的纯化方案 2 包含体分离纯化的一般过程 细胞破碎　　离心沉降回收包含体　　包含体的洗涤（EDTA、低浓度的变性剂或表面活性剂，溶解膦脂、膜蛋白质） 离心沉降回收包含体 可反复进行洗涤、离心回收 3 包含体的溶解 溶解目的：使目标蛋白质肽链伸展，为进一步复性创造条件 利用高浓度的强变性剂，像6-8mol/L盐酸胍或8mol/L尿素(盐酸胍好于尿素)、硫氰酸盐 表面活性剂：SDS，十六烷基三甲基氯化胺 还原剂：DTT，β-巯基乙醇，半胱氨酸 螯合剂：清除重金属离子，消除氧化作用 4 蛋白质复性（了解） 1961年，Anfinsen发现，在自由能驱动下，变性后的牛胰核糖核酸酶(RNase A)可在体外通过空气氧化自发形成正确的二硫键。 提示了蛋白质一级结构和高级结构的关系。 蛋白质的一级结构含有其折叠成熟所需的全部信息，变性的蛋白质在一定条件下可以完全自发地恢复活性。 变性蛋白质溶解在高浓度变性剂中，降低变性剂浓度至非变性浓度范围，就可引发蛋白质折叠复性。 蛋白质复性 氧化复性：对于含二硫键的蛋白质，需要添加氧化剂和还原剂，调节复性液氧化还原环境，促进正确二硫键的形成。 通常在弱碱性(pH=7.5-9.5)缓冲液中进行，有利于硫醇阴离子的形成，促进二硫键的形成和交换。 5 常用的氧化/还原剂 GSSG/GSH 胱氨酸/半胱氨酸 在Cu2+存在下的空气氧化 6 复性折叠过程假说 从低级结构到高级结构的逐步演化的“完美”假说 塌陷—调整—折叠 （“塌陷”假说） 7 蛋白质复性过程 可借助简化的竞争反应动力学模型 表示 蛋白质复性的主要挑战就是创造适宜的复性条件，最大程度地抑制聚集体的生成，提高复性收率。 包含体蛋白的复性被认为是一种复杂的、经验性很强的工作。 8 稀释复性 最简单，最常用，传统方法 具体模式：直接稀释复性、透析复性、流加复性 1）直接稀释复性：将变性蛋白质溶液直接稀释到适宜的复性缓冲液中 稀释复性动力学（了解思路） 根据竞争反应动力学模型，可以列出稀释复性动力学方程 蛋白质复性收率：N/U0 蛋白质复性收率随浓度提高而降低 主要是通过降低变性蛋白质的浓度来实现 2）流加复性方法 将变性蛋白质分多批次加入到复性液中，或采用连续流加到复性液中 在复性液中变性蛋白质浓度(折叠中间体)浓度始终保持在较低的水平 直接稀释复性流加复性（异同） 9 辅助因子的作用 在稀释复性中添加各种小分子溶质，以抑制聚集体的生成 又称“稀释添加”复性 添加剂辅助蛋白质复性的机理 1.稳定天然态蛋白质的结构，降低错误折叠蛋白质的稳定性 如甘油 2.提高折叠中间体或伸展肽链的溶解度(稳定性) 如低浓度变性剂、聚乙二醇（PEG)、表面活性剂 辅助蛋白质复性的稀释添加剂 辅助蛋白质复性的稀释添加剂 使用稀释添加剂需注意的问题 选择性，如聚乙二醇可辅助碳酸脱水酶复性，但对溶菌酶复性无影响 最佳浓度范围，对于稳定折叠中间体或伸展肽链的添加剂，其辅助作用在一定浓度范围有效 复性剂的最佳浓度或浓度范围与蛋白质种类和浓度有关 常需更长的复性操作时间 选用复性方法的原则：在包含体蛋白质的复性中，若利用盐酸胍或尿素溶解包含体，应首先考虑通过调节盐酸胍或尿素的浓度来获得满意的复性效果。只有在复性效果不佳的情况下才考虑其他添加剂。 表面活性剂、添加剂的去除是必须考虑的问题。 * * N A U I 折叠过程中的中间态是20世纪70年代蛋白质折叠研究的一个重大突破。 磷脂 吐温 月桂醇麦芽糖苷 十六烷基三甲基溴化胺 十二烷基磺酸钠 Triton X-100 聚乙二醇 表面活性剂 L-精氨酸 氨基酸 尿素(1-4mol/L) 盐酸胍(0.5-2mol/L) 低浓度变性剂 物质名称 分类 硫酸铵，氯化锂，氯化钠，硫酸钠，硫酸钾 无机盐 硫化甜菜碱 硫脲 肌氨酸 乙酰胺 丙酮 三羟甲