实时荧光定量PCR产品质量标准要点分析李丽莉.pdfVIP

中国生物制品学杂志2012 年8 月第25 卷第8 期 Chin J Biologicals August 2012 ，Vol. 25 No. 8 · · 1069 · · 专题报道 实时荧光定量PCR 产品质量标准要点分析 李丽莉，赵慧，白东亭 【关键词】 实时荧光定量PCR ；质量标准；质量控制 【中国图书分类号】Q78 R392-33 【文献标识码】A 【文章编号】 1004-5503 （2012）08-1069-03 自1985 年问世以来，PCR 技术以其灵敏性、特 应管内的荧光信号到达设定的域值的时刻，可见Ct 异性和快速性在医学和分子生物学等领域得到了广 值取决于阈值。③ΔRn: 是指模板DNA 的起始拷贝 泛的应用。近年来出现的核酸定量PCR 技术，尤其 数。Ct 值与ΔRn 成反比。 是实时荧光定量PCR （Real-time fluorescence quanti－ tative PCR ，FQ-PCR）技术，实现了PCR 从定性到定 3. FQ-PCR 技术要点 量的飞跃，以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量 3. 1 样本制备：根据诊断的需要选取特定的样本用 准确、速度快、全封闭反应等优点成为分子生物学研 来进行FQ-PCR ，使用样本的来源较为广泛，有尿液、 究、医学研究和疾病诊断中的重要工具。本文对 血清、拭子样本、粪便等。将采集的样本置于灭菌试 FQ-PCR 试剂的技术要点和质量标准进行分析。 管中，密闭送检。样本可立即用于检测，也可于-70℃ 保存，但不宜反复冻融，应采用低温运送。冻存样本 1. FQ-PCR 技术的基本原理 使用前应在室温融化并充分混匀，取适量待测样本， FQ-PCR 技术是指在PCR 反应体系中加入荧光 按比例加入核酸裂解液，按试剂说明书制备核酸样 基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程， 本。阴性质控品、阳性质控品及定量参考品进行同步 最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 处理。 法。在FQ-PCR 中，对整个扩增过程进行实时监测和 3. 2 PCR 扩增：PCR 反应混合液经室温融化并充分 连续分析，随着反应时间的延续，将荧光信号的变化 混匀后，2 000 r ／ min 离心10 s，取适量加至PCR 反 绘制成一条曲线。一般而言，荧光扩增曲线可分为3 应管，分别加入处理后的阴性质控品、阳性质控品、 个阶段: 荧光背景信号阶段、荧光信号指数扩增阶段 定量参考品，盖紧反应管，8 000 r ／ min 离心数秒，将 和平台阶段。在荧光背景信号阶段，扩增的荧光信号 各反应管按顺序放至PCR 扩增仪，按说明书规定程 被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。而 序进行PCR 扩增。 在平台阶段，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR 3. 3 数据分析：反应结束后，根据图像调节Baseline 的终产物量与起始模板量之间无线性关系，不能根 的Start 值、End 值以及Threshold 值（可根据实际情 据最终的PCR 产物量计算起始DNA 拷贝数。只有 况自行调整，Start 值可以在3 ～ 15、End 值可设在5 ～ 在荧光信号指数扩增阶段，PCR 产物量的对数值与 20 ，调整阴性对照的扩