乳腺癌中NDRG-1基因甲基化状态探究.docVIP

乳腺癌中NDRG-1基因甲基化状态探究[摘要] 目的 研究NDRG1基因启动子区甲基化状态，探讨NDRG-1基因甲基化在乳腺癌发生中的作用。方法 采用双色荧光杂交微阵列基因芯片技术对33对乳腺癌标本和癌旁组织标本NDRG-1基因启动子区甲基化状态进行研究。结果 肿瘤标本和癌旁组织标本中NDRG-1基因启动子区CpG位点均有不同程度的甲基化，肿瘤组织中NDRG-1基因启动子区CpG位点甲基化率明显高于相应的癌旁组织（t=14.12，P 1.4PCR扩增? 为了能同时扩增甲基化和非甲基化DNA，设计的引物中不含有ＣpG位点。前引物PF-5′-GGTTTA GGGTGTGTTATAGTGTAATA-3′,后引物PR-5′-CCTA ACTCCAACCAACTCAAAAA-3′（扩增基因序列Genebank no：NC_000008.9，前引物位置为781-806，后引物位置为933-957）。PCR反应体系50μl，其中含10×buffer3μl，Mg2+1.8mmol#8226;L-1，dNTPs200μmol#8226;L-1，每条引物各1μl，模板DNA2μl，Ｔaq DNA聚合酶2U。PTC-225 热循环仪（MJ Research）上进行PCR扩增：?95℃预变性5min，然后95℃变性50s，59℃复性?45s，72℃延伸45s，共35个循环，最后72℃再延伸?5min。取 ５μlPCR反应产物在1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，Syngene公司凝胶成像系统下观察并记录图像。采用DNA纯化试剂盒（TAKARA）对PCR产物进行纯化，纯化后的DNA进行芯片点样。? 1.5阴性阳性样本克隆与测序? 正常人血液DNA扩增的阴性PCR产物和经过M.SssI处理DNA扩增阳性PCR产物割胶纯化（TAKARA），克隆到pMD18-T载体（TAKARA）中（根据pMD18-T载体说明书操作），分别挑取2个阴性和阳性克隆并测序（由上海英骏生物技术有限公司完成），测序正确的克隆提取质粒并保存于-20℃待用。? 1.6 探针及丙烯酰胺标记引物合成? 寡核苷酸探针由上海英骏生物技术有限公司合成并标记，PM1-3#是与甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy5；PU1-3#是与未甲基化的位点完全匹配的探针，标记为cy3。NDRG-1-P-L#是丙烯酰胺标记引物，由上海超世生物公司合成并标记，标记为Acrydite。见表1。?? 表1 探针与PCR扩增未经亚硫酸氢钠处理的原序列 1.7 芯片制备? 将纯化后的PCR产物与丙烯酰胺、10％过硫酸胺和甘油等按照比例混合后，吸取20μl样本点至一块384孔板（AxyGen），准备机点或者手点。机点采用点样仪（CapitalBio SmartArrayerTM-48）将准备好的PCR产物点于处理好的玻片上，两个点圆心之间的距离为300~500μm。? 1.8 杂交? 取等量PM1-3#和PU1-3#混合，使得每种探针浓度为1pmol#8226;L-1，再与杂交液（Telechem）1∶3混合。取25μl探针溶液均匀覆盖于玻片上面，加盖经离水处理的盖玻片，放入湿润密闭的杂交盒中，45℃、37℃各杂交1h。取出玻片，用70%甲酰胺70℃变性15min，变性电泳1h，在室温下用灭菌双蒸水反复清洗后氮气吹干玻片。? 1.9 图像扫描与数据处理? 杂交清洗后的玻片采用双色共聚焦扫描仪[CapitalBio LuxScanTM-10K（A），中国博奥]扫描，分别记录cy3和cy5滤片扫描的图像，采用Genepix Pro 3.0分析结果，记录每个点的荧光强度，最后将记录下来的数据用Microsoft Office Excel 2003统计并制表。统计分析用SPSS13.0软件，采用t检验，P 对于NDRG-1基因的启动子区甲基化状态研究，国内外尚无研究报道。本实验利用双色荧光杂交微阵列基因芯片技术对NDRG-1基因启动子区甲基化水平进行定量检测，发现CpG位点肿瘤组织和对应癌旁组织的甲基化率分别为40.76%和22.41%，差异有统计学意义。因此可以推测甲基化调控机制可能是NDRG-1基因的重要调控途径之一，从而与乳腺癌的发生相关。? [参考文献]? [1]van Belzen N,Dinjens W N,Diesveld M P,et al.A novel gene which is up-regulated during colon epithelial cell differentiation and down-regulated in colorectal neoplasms [J].La