乳腺癌中转化生长因子TGFβ1mRNA及蛋白表达及意义.docVIP

乳腺癌中转化生长因子TGFβ1mRNA及蛋白表达及意义【摘要】 目的 探讨转化生长因子TGFβ1 mRNA及其蛋白在乳腺癌中的表达及其意义。方法 采用RT-PCR和免疫组织化学法分别检测96例乳腺癌新鲜组织及对应60例石蜡组织中TGFβ1 mRNA及蛋白的表达。结果 乳腺癌中TGFβ1 mRNA及蛋白的高表达率分别为45．83%、43．33%，明显高于其在乳腺良性增生组织(26．67%，20%)及正常乳腺组织(9．09%，0)中的表达，差异有统计学意义(P1．8时，方可用于RT-PCR检测。 1．5 cDNA合成和PCR反应 取总RNA 1．5 μg，按逆转录试剂盒说明合成cDNA。PCR扩增条件：总体积50 μl，10×PCR buffer 5．0 μl，25 mmol MgC1?2 3．0 μl，10 mmol dNTP 1．0 μl，10 pmol/μl TGF-β1引物1．0 μl，10 pmol/L β-actin引物1．0 μl，5 U/μl Taq酶0．4 μl，cDNA模板2．5 μl，蒸馏水36．1 μl。PCR扩增循环参数为：94℃5 min变性，94℃ 20 s，68℃20 s，72℃1 min，循环35次，72℃延长反应5 min。取扩增产物5μl，2．3％琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外灯下观察结果。 1．6 结果判断 电泳结果在紫外光下采像，并应用凝胶电泳图像分析系统分析，用目的基因/内参β-actin两电泳条带的单位面积内的灰度比值/A值(即半定量)来反映目的基因的相对表达水平。计算公式为：目的基因相对表达水平=(目的基因灰度值-背景灰度值)/(内参β-actin度值-背景灰度值)。表达水平相对A值≥1．83为高表达。 1．7 免疫组织化学法 采用SP法进行染色，实验步骤按试剂盒说明。4 μm切片，经柠檬酸缓冲液微波修复15 min，DAB显色、苏木精复染，中性树胶封固，TGFβ1抗体工作浓度1∶200，PBS 代替一抗作阴性对照，DAB 显色，苏木素复染，中性树胶封片。染片背景清晰，肿瘤细胞胞浆和/或胞核出现棕黄色为阳性，随机选取10个高倍视野(×400)，计数1000个癌细胞计算阳性细胞率，阳性细胞率0~5％为阴性(-)，5％~25％为弱阳性(+)，25％~50％为阳性(++)，50％以上为强阳性(+++)。“+”视为低表达，“++”及“+++”视为高表达。 1．8 统计学分析 应用SPSS10．0 统计软件包，进行χ2 检验，P0．05 为差异有统计学意义。 2 结果 2．1 TGFβ1 mRNA表达情况 96例乳腺癌中40例(45．83%)呈高表达，明显高于乳腺良性增生组织(4/15，26．67%)和正常乳腺组织(1/11，9．09%)，前者与后二者差异有统计学意义(P0．05)。RT-PCR电泳结果见图1。 2．2 TGFβ1蛋白表达情况 60例乳腺癌石蜡组织中有40例呈阳性表达(66．67%)，明显高于乳腺良性增生组织(5/15，33．33%)和正常乳腺组织(2/11，18．18%)差异具有统计学意义(P0．05)；乳腺癌TGFβ1蛋白高表达(26/60，43．33%)，亦比乳腺良性增生组织(3/15，20%)和正常乳腺组织(0/11)明显升高。表达部位主要是肿瘤细胞胞浆，少数位于细胞核(图2)。 2．3 TGFβ1 mRNA及蛋白表达与乳腺癌临床指标的关系 由表2可见，TGFβ1 mRNA与蛋白表达与肿瘤大小、临床分期、ER、PR 表达均无关，而在乳腺癌腋淋巴转移组TGFβ1 mRNA及其蛋白高表达率分别为64．29％(36/56)、57．14％(20/35)，均明显高于无腋淋巴结转移组的20．00％(8/40)、24．00％(6/25)，两组表达的差异有统计学意义(P0．01)。 3 讨论 TGFβ是人体多种组织细胞内的一类多功能的多肽类生长因子，广泛参与各种病理生理过程,对细胞的增殖与分化、细胞外基质的产生、创伤的愈合、胚胎发育、血管生成、细胞凋亡及机体免疫系统均有着重要作用[8]。TGFβ1是TGFβ家族的成员，是人体内主要的存在形式。TGFβ1在许多细胞中具有广泛复杂的作用,对于正常上皮细胞发挥普遍的生长抑制效应，控制细胞生长促进细胞凋亡； 而对于肿瘤细胞则起双向调节作用，在肿瘤形成早期能抑制肿瘤形成,而在肿瘤的发生、发展过程中则有促进作用[9]。在多种肿瘤中表达增高，TGFβ1表达上升和对作为生长抑制因子的TGFβ1失去反应性与组织恶性转化及进展相关。 本研究发现：TGFβ1 mRNA及蛋白在乳腺癌过表达，高表达率明显高于乳腺良性增生组织和正常乳腺组织，差异有统计学意义(P0．05)。这与国内外一些研究结果类