参力加颗粒剂对心力衰竭大鼠心肌MMP-9表达影响.docVIP

参力加颗粒剂对心力衰竭大鼠心肌MMP-9表达影响[摘要]目的：应用蛋白芯片技术筛选并分析参力加颗粒对心力衰竭大鼠心肌MMP－9表达的影响。方法：用阿霉素制备心力衰竭动物模型，70只大鼠随机分为空白对照组、模型组、中药组，分别用生理盐水和参力加颗粒灌胃，每日2次。4周后取大鼠左心室组织。用于HE染色和蛋白芯片分析。结果：HE染色显示空白对照组心肌正常；模型组心肌纤维增粗、紊乱，间质增生，少量炎症细胞浸润；中药组心肌排列较整齐，间质无明显增生，少量炎症细胞浸润。蛋白芯片可见MMP－9存在差异性表达，与空白对照组相比，模型组的表达上调；中药组的表达下调；治疗组与空白对照组相比无表达差异。结论：参力加颗粒通过调节MMP－9的表达，改善心肌纤维化程度，对心力衰竭大鼠心脏起保护作用。 [关键词]参力加颗粒；心力衰竭；蛋白芯片；MMP－9 [中图分类号]R285.5　[文献标识码]A　[文章编号]1007－8517(2011)09－0032－02 心力衰竭(Heart Failure)是由多种病因引起的心肌收缩功能和/或舒张功能障碍的病理综合症，其复杂的病理生理机制尚未彻底阐明。参力加颗粒是课题组治疗心力衰竭的经验方，临床应用多年，疗效确切、可靠。前期实验证明其有良好的扩张血管、降压利尿、增加心肌收缩力、减轻心室重构、改善心功能等药理作用。蛋白芯片能够在一次实验中平行高通量地比较几十或几百种细胞中重要功能蛋白质的表达变化。能够从多通路、细胞分子和整体水平揭示疾病的发生发展与治疗机制。本实验拟通过蛋白抗体芯片技术筛查参力加颗粒对心力衰竭大鼠心脏功能蛋白的表达，以期从细胞分子和整体水平揭示参力加颗粒对心力衰竭大鼠心脏的保护机制。 1、材料与方法 1.1实验动物 清洁级健康Wister大鼠70只，雄性，体重250±5g。饲养环境：室温20－22℃，自由饮水，饲固体颗粒。大鼠及饲料均由黑龙江中医药大学验动物中心提供。 1.2主要药品及试剂 阿霉素：深圳万乐药业有限公司。 参力加颗粒：(人参、红景天、葶苈子、五加皮等药物组成)由黑龙江中医药大学中药制剂室提供。 蛋白芯片实验研究在上海康成生物工程有限公司完成，相关药品及仪器均由该公司提供。 1.3分组与造模 雄性Wister大鼠适应性喂养1周后，按随机数字表将70只大鼠随机编号并分为空白对照组(20只)、模型组(25只)、中药组(25只)。按李玉玲等的方法并加以改进，将注射用的盐酸阿霉素用注射用水配制成2mg／mL溶液，按4mg／kg，即2mL／kg剂量给予模型组；中药组大鼠腹腔注射，每周1次，共4周，累积总量16mg／kg；空白对照组大鼠腹腔注射等量生理盐水。 1.4给药方法 末次注射一周后给予药物干预，空白对照组及模型组予生理盐水2mL灌胃，中药组给予中药灌胃治疗。给药剂量按人与动物体质量一剂量换算公式：大鼠的剂量(mg／kg)＝w×人的剂量(mg／kg)，w是换算系数在这里约等于6.5，制备药液浓度为0.185g／ml，每天2次给药，每次2ml，共计给药四周。 1.5标本采集及病理 末次灌胃禁食12小时后，每组取存活大鼠8只，用20％乌拉坦(1g／kg)腹腔注射麻醉，将麻醉大鼠固定于实验台，沿正中线切开胸壁暴露心脏，迅速用无菌手术剪刀摘取心脏，置人装有4℃冰盐水的培养皿中冲洗，冲洗后在冰块上剥离、剪取左室心肌，取心尖部组织置于4％多聚甲醛中固定，常规脱水，石蜡包埋，切成10μm厚的切片，脱蜡，HE染色，镜下观察组织形态学。部分置于液氮中保存送上海康成生物工程有限公司完成蛋白芯片实验。 1.6样品蛋白质抽提、定量和芯片分析 在干冰冰面上，分别切取各组大鼠适量(250－500mg)心肌组织，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂，匀浆后(按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作)，测定样品浓度。将所得符合标准的蛋白质提取液吸取适量(50－500ug)加到封闭好的蛋白芯片(RayBioTM大鼠L系列抗体芯片Ⅰ)反应槽中，随后加入链亲和素标记抗体，室温孵育1小时。待反应完全后将芯片膜与化学发光底物反应，通过x射线胶片曝光，使检测结果在胶片上显示。 1.7图象和数据采集与分析 x－射线胶片曝光后，将胶片上的图象用扫描仪扫描并转换为灰度TIFF格式的图片文件保存。运行ScanAlyze软件，将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据。每张芯片的原始数据经校正后，用来进行样品间细胞因子表达的相对丰度分析。其相对丰度比?1.5或?0.6667为临界值，筛分出空白对照组、模型组和中药组三者间的差异表达蛋白。 2、结果 2.1 HE染色 空白对照组心肌细胞纹理清晰，胞核位于