弥漫性脑损伤大鼠肠道防御素-5mRNA表达.docVIP

弥漫性脑损伤大鼠肠道防御素-5mRNA表达[摘要]目的 探讨弥漫性脑损伤后肠道防御素-5(RD-5)变化。方法 大鼠32只，分为对照组(n=8)，弥漫性脑损伤组(n=24)，再分成3个亚组(24h、3d、7d)。观察回肠RD-5mRNA的表达，回肠肠黏膜的病理改变以及血液内毒素的变化。结果 弥漫性脑损伤后24h RD-5mRNA的表达显著升高(P210，表明RNA纯度较高。采用逆转录酶和oligo(dt)15引物进行逆转录，所有操作均严格按照逆转录试剂盒说明进行。取2μg总RNA作为模板，－20℃保存产物。采用高温启动法进行PCR循环，所有物品高压灭菌。DNA聚合酶采用TaKaRa Ex Taq酶(购自大连宝生物工程有限公司)，RD-5引物序列为：上游引物5－ATCGGT GGC CTC ACT C－3，下游引物5－TCG CAGCCA TGA AGA AAC TF－3。β－actin为内参。PCR条件：94℃3min，94℃30s，55℃30 s，72℃30s，33个循环，最后72℃延伸10min。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。扩增产物用1.5％的琼脂糖电泳，溴乙锭染色检测，GIS－1000凝胶图象分析系统(购自中国上海天能科技有限公司)分析。 1.3 体静脉血内毒素的测定[5-6] 试剂盒由上海医化所提供，采用鲎试剂与合成基质偶氮显色法测定。 1.4 肠黏膜病理标本 在各时间点取回肠5cm，浸泡于福尔马林液中，HE染色，光镜观察。 1.5 统计学处理 所有数据以均数±标准差( ±s)表示，用SPSS11.5软件进行方差分析，采用Dunnett-t检验法，以P 肠绒毛紊乱、脱落等，使肠道机械免疫屏障破坏。文献[8-9]应用相同的模型，也观察到弥漫性脑损伤后小肠黏膜萎缩，肠绒毛缩短，黏膜上皮细胞变性等损伤改变。另外本实验也测定了大鼠静脉血内毒素的改变，颅脑创伤后24h至7d静脉血内毒素明显增加，说明肠黏膜的损伤已经使得肠道内细菌移位，产生内毒血症。而作为肠道免疫重要组成的防御素是否因为肠黏膜的损伤而降低呢? 研究表明，防御素主要位于哺乳动物的小肠，由潘氏细胞分泌到隐窝腔，然后被运送到肠腔，它在大鼠回肠的浓度最高[1]，因此本实验主要观察大鼠回肠RD-5 mRNA的变化。在大鼠头部受到打击导致弥漫性脑损伤后24h测定RD-5 mRNA的表达，发现明显高于正常大鼠。Condon等[10]。在失血性休克模型大鼠中应用RT-PCR测定RD-5mRNA水平变化，结果发现终止休克以后，回肠中RD-5 mRNA水平比对照组增加10倍；杨洪明等[11]的烫伤大鼠复苏后8h测定RD-5 mRNA的结果明显高于对照组，24h仍维持较高，3d后下降。此外Tanabe等[1]在小鼠坏死性胰腺炎的模型中测定防御素mRNA的表达，发现其降低并呈现动态变化。结合本实验可以看出，在不同的疾病状态下，虽然都存在肠道黏膜的损伤，但是防御素的表达并不一致。 有关肠道RD-5分泌的调节机制，目前仍不明了，在弥漫性脑损伤24h大鼠回肠黏膜RD-5mRNA表达为何明显增加?笔者分析认为可能由于潘氏细胞位于小肠隐窝底部，颅脑创伤后肠黏膜充血．肠微绒毛损伤并未影响到潘氏细胞，该类细胞仍然保持合成、分泌RD-5的功能，同时由于炎性细胞的刺激促进RD-5合成增加[12]。但是，此时RD-5的增加不足以完全阻止细菌移位和血液中内毒素的升高，为内毒素血症的出现提供了条件，内毒素血症的发生是产生MODS的重要因素。笔者的实验结果表明3d以后大鼠肠道内防御素RD-5下降，但是内毒素仍然维持较高水平。因此，重度颅脑创伤后出现的内毒素血症与肠道免疫功能下降有关。一些攻下的中药，如大黄，可能有诱导防御素表达的作用，对防治重度颅脑损伤后并发的MODS可能有一定帮助。 1