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附录一试验室常用溶液配制.DOC

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附录一试验室常用溶液配制

一、常用贮液与溶液 (一)常用缓冲液 1.磷酸缓冲液 (1)25℃下0.1mol/L磷酸钾缓冲液的配制※ pH 1mol/L K2HPO4(mL) 1mol/L KH2PO4(mL) 5.8 8.5 91.5 6.0 13.2 86.8 6.2 19.2 80.8 6.4 27.8 72.2 6.6 38.1 61.9 6.8 49.7 50.3 7.0 61.5 38.5 7.2 71.7 28.3 7.4 80.2 19.8 7.6 86.6 13.4 7.8 90.8 9.2 8.0 94.0 6.2 (2)25℃下0.1mol/L磷酸钠缓冲液的配制※ pH 1mol/L Na2HPO4(mL) 1mol/L NaH2PO4(mL) 5.8 7.9 92.1 6.0 12.0 88.0 6.2 17.8 82.2 6.4 25.5 74.5 6.6 35.2 64.8 6.8 46.3 53.7 7.0 57.7 42.3 7.2 68.4 31.6 7.4 77.4 22.6 7.6 84.5 15.5 7.8 89.6 10.4 8.0 93.2 6.8 ※:用蒸馏水将混合的两种1mol/L贮存液稀释至1000mL,根据Henderson-Hasselbalch方程计算其pH值: pH=pK’+1g([质子受体]/[质子供体]) 在此,pK’=6.86(25℃)。 2.电泳缓冲液 常用的电泳缓冲液 缓冲液 使用液 浓贮存液(每升) Tris-乙酸(TAE) 1×:0.04mol/L Tris-乙酸 50×:242g Tris碱   0.001mol/L EDTA 57.1mL冰乙酸     100mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-磷酸(TPE) 1×:0.09mol/L Tris-磷酸 10×:10g Tris碱   0.002mol/L EDTA 15.5mL85%磷酸(1.679g/mL)     40mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0) Tris-硼酸(TBE)a 0.5×0.045mol/L Tris-硼酸 5×:54g Tris碱   0.001mol/L EDTA 27.5硼酸     20mL 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 碱性缓冲液b 1×:50mmol/L NaOH 1×:5mL 10mol/L NaOH   1mmol/L EDTA 2mL 0.5mmol/L EDTA(pH8.0) Tris-甘氨酸c 1×:25mmol/L Tris 5×:15.1g Tris   250mmol/L 甘氨酸 94g 苷氨酸(电泳级)(pH8.3)   0.1% SDS 50mL 10% SDS(电泳级) 说明: ①TBE溶液长时间存放后会形成沉淀物,为避免这一问题,可在室温下用玻璃瓶保存5×溶液,出现沉淀后则予以废弃。 以片都以1×TBE作为使用液(即1:5稀释浓贮液)进行琼脂糖凝胶电泳。但0.5×的使用液已具备足够的缓冲容量。目前几乎所有的琼脂糖胶电泳都以1:10稀释的贮存液作为使用液。 进行聚丙烯酰胺凝胶垂直槽的缓冲液槽较小, 故通过缓冲液的电流量通常较大,需要使用1×TBE以提供足够的缓冲容量。 ②碱性电泳缓冲液应现用现配。 ③Tris-甘氨酸缓冲液用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。 3.凝胶加样缓冲液 缓冲液类型 6×缓冲液 贮存温度 Ⅰ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青FF 40%(W/V)蔗糖水溶液 Ⅱ 0.25溴酚蓝 室温 0.25%二甲苯青FF 15%聚蔗糖(Ficoll400) Ⅲ 0.25%溴酚蓝 4℃ 0.25%二甲苯青FF 30%甘油水溶液 Ⅳ 0.25%溴酚蓝 4℃ 40%(W/V)蔗糖水溶液   碱性加样缓冲液:   300mmol/L NaOH 6mmol/L EDTA Ⅴ 18%聚蔗糖(Ficoll400) 4℃ 0.15%溴甲酚绿 0.25%二甲苯青FF 使用以上凝胶加样缓冲液的目的有三:增大样品密度;以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色,从而使加样操作更为便利,含有在电块中能以可预知速率向阳极泳动的染料。溴酚蓝在琼脂糖中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍,而与琼脂糖浓度无关。以0.5×TBF作电泳液时,溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同,而二甲苯青FF的泳动则与长4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5%~1.4%的范围内,这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著。 选用哪一种加样染料纯属个人喜恶。

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