苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量.docVIP

苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量【关键词】蛹虫草多糖；苯酚-硫酸法；含量 ? 蛹虫草（Cordyceps militaris）,别名北冬虫夏草、北虫草。野生蛹虫草具有多种药用价值、滋补功能，可与人参、鹿茸相媲美。其所含的虫草素、甘露醇、SOD等成分，均达到或超过名贵中药冬虫夏草。具有抗疲劳、抗衰老、增强免疫和性功能等作用，可杀灭喉癌细胞，能补肺益肾壮阳，有扶虚损、益精气、止血、化痰、镇静、免疫等多种功能。其有效活性成分虫草多糖(CMPS)被认为是非特异性免疫调节剂,可激活肌体的免疫活性细胞。本文通过苯酚-硫酸法,测定蛹虫草中多含量，此方法简便、结果准确、重现性好、颜色稳定。因此，可采用苯酚-硫酸法测定蛹虫草中多糖含量。? 1材料与方法? 1．1材料 蛹虫草由抚顺师专生化系蛹虫草课题组提供。? 1．2仪器与试剂 浓硫酸（GR）95%乙醇和无水葡萄糖均为市售分析纯。苯酚试剂： 取苯酚(CP 200 g 、加铝片0．2 g和碳酸氢钠0．1 g，蒸馏，收集180 ℃左右馏分。将新蒸苯酚配成6%溶液，放入棕色瓶，置于冰箱中保存备用。其它均为分析纯。 UNIC7200型分光光度计(上海尤尼科仪器有限公司)? 1．3方法? 1．3．1蛹虫草多糖的提取与精制 新鲜的蛹虫草，烘干，粉碎后，用无水乙醇提取数次，残渣风干。取适量干粉，放于磨口三角瓶中，按料水比1∶20，在温度100 ℃的热水浴中回流浸提2 h，冷却后离心，合并上清液。上清液用酶法去除淀粉，按20 U/g加液化酶到上清液中，在pH为6，温度为65 ℃的水浴条件下处理，用I2/KI溶液检验，直到碘液不变色为止。接着用Sevag法除去蛋白质，在水浴挥去有机相，H?2O?2除色，然后加3倍体积95%乙醇溶液，冷冻离心机离心，冷冻干燥即得精制CMPS。? 1．3．2葡萄糖标准曲线的测定? 精确称取105℃干燥恒重的葡萄糖100 mg，置于100 ml容量瓶中定容，摇匀。取10 ml溶液于100 ml容量瓶中定容，摇匀(含葡萄糖100 μg/ml)，备用。分别吸取葡萄糖标准溶液0．1、0．2、0．3、0．4、0．5、0．6、0．7、0．8 ml,用蒸馏水补充至2．0 ml加入5%的苯酚溶液1 ml，摇匀，加入浓硫酸5 ml室温下放置10 min，于490 nm处测定吸光度值(以2．0 ml蒸馏水作为空白)，得到回归方程为： A=0．009 1Cr=0．997 6 其中：A为吸光值，C为葡萄糖浓度? 1．3．3样品液的制备? 称取用无水乙醇处理过的蛹虫草干粉10 g，按照最优提取方案进行提取，除淀粉，除蛋白，用95%的乙醇沉淀，4 000 r/min离心，沉淀用蒸馏水溶解，用500 ml的容量瓶定容，即得样品液。? 1．3．4换算因子的测定 精密称取干燥至恒重的精制CMPS粉末5mg，置于50 ml容量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀备用。精密量取该贮备液1．0 ml，按照“1．3．2”的方法测定吸光度，计算出多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子，F=W/(C.D)，W为多糖重量(mg)，C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释因素，测得F=2．031(n=3)。? 1．3．5稳定性试验 取样品供试液，按葡萄糖标准曲线测定方法，将同一份反应液间隔一定时间，测定吸光值。? 1．3．6精密度试验 取样品供试品溶液，按葡萄糖标准曲线所述的含量测定方法，重复测定5次，记录吸光值。? 1．3．7回收率试验 采用加样回收法。吸取多糖样品溶液0．5 ml，分别加入标准葡萄糖溶液0．1、0．2、0．3、0． 4 、0．5 ml，按照上述方法分别测其吸光度，根据葡萄糖的检出量，计算其回收率。结果见表1。回收率=(实验测值-样品所含被测成分量)/加入纯品量*100％? 1．3．8多糖含量的测定 吸取样品液1．0 ml，用重蒸水定容至100 ml，取定容液1．0 ml，按上述步骤操作，同时做5个重复，测吸光度，以标准曲线和下式计算样品中多糖的百分含量。多糖含量(%)=C.D.F/w C为供试液葡萄糖浓度，D为供试液的稀释因素，F为换算因素，W为供试品的重量。? 2结果与分析? 2．1稳定性试验结果间隔10、20、30、40、60 min测定的吸光度分别为0．448、0．449、0．448、0．450、0．449。稳定试验RSD为0．167% ，表明样品在60 min内稳定性良好。? 2．2精密度试验结果测定1、2、3、4、5次吸光度值分别为0．445、0．443、0．447、0．444、0．445 精密度试验RSD为0