调节性T细胞在胸腺中原位表达及其对重症肌无力(MG)发病意义.docVIP

调节性T细胞在胸腺中原位表达及其对重症肌无力(MG)发病意义【摘要】目的：观察探讨调节性T细胞（Tregs）在胸腺中原位表达及其对重症肌无力（MG）发病的关系。方法：选取我院2009年3月至2011年3月28例行胸腺扩大切除的MG患者，设为观察组，再选取28例同期行胸腺部分切除的手术患者，设为对照组，分别对其胸腺中的Tregs进行定位及定量分析，观察比较两组测定结果。结果：两组受检者Tregs相对数量（CD4+CD25+Tregs所占阳性表达区域的细胞比例）比较存在一定差异（P＜0.05），具有统计学意义。结论：MG的发生与Tregs相对数量，即CD4+CD25+Tregs所占阳性表达区域的细胞比例发生失衡，引起机体内抑制功能及免疫调节作用降低有一定关系。 【关键词】调节性T细胞；胸腺；原位表达；重症肌无力 【中图分类号】R746.1 【文献标识码】B 文章编号：1004-7484（2012）-04-0310-02 许多文献中皆指出，重症肌无力（MG）的发病与胸腺发生异常有一定的关系，而胸腺中的调节性T细胞，即CD4+CD25+Tregs的相关研究在近年来指出［1］，其对机体的免疫耐受性维持有重要的作用。本文通过观察探讨调节性T细胞（Tregs）在胸腺中原位表达及其对重症肌无力（MG）发病的关系，总结其临床意义如下： 1.资料与方法 1.1 一般资料：选取我院2009年3月至2011年3月28例行胸腺扩大切除的MG患者，设为观察组，男12例，女16例，年龄在4-57岁，平均年龄为31±1.2岁，均经过新斯的明试验呈阳性反应，皆表现为典型的MG疲劳病征，经电生理检查证实为MG患者。按照Osserman分型可分为I型13例，IIa型8例，IIb型7例，无III、IV型的患者，皆无在行手术前行免疫治疗，均排除术前行免疫治疗或近期有感染的患者；再选取28例同期行胸腺部分切除的手术患者，设为对照组，男13例，女15例，年龄在4-58岁，平均年龄为32±1.3岁，皆无在行手术前行免疫治疗，均排除患有自身免疫性疾病、术前行免疫治疗或近期有感染的患者；两组患者皆为自愿签署知情同意书进行试验，并经伦理委员会批准，分别对其胸腺中的Tregs进行定位及定量分析，观察比较两组测定结果。两组患者从年龄、性别、病史等方面均无显著差异（P＞0.05），具有可比性。 1.2 测定方法： 1.2.1 采集处理：对手术切除后的胸腺组织进行标本采集，大小为0.5cm×1cm，放入液氮中速冻，然后置于零下80度的冰箱中备用，对采集的胸腺标本快速进行加OCT包埋，制成厚度为4μm的冰冻组织切片，并将其粘在以多聚赖氨酸进行处理的玻片上，置于室温空气下展片。在4℃下以4％的多聚甲醛进行10min固定，并采取浓度为0.01mol/L的PBS进行3次的漂洗，将多聚甲醛和OCT去除。 1.2.2 免疫荧光组织化学染色方法：采用10％的山羊血清/PBS作为封闭液，置于室温下进行60min封闭后，将封闭液除去，无需清洗，然后加入比例为1：50的小鼠抗人CD25单克隆抗体（NoMarkers公司提供）和比例为1：100的兔抗人CD4多克隆抗体(SantaCruz公司提供)进行混合的一抗；在对阴性对照标本使用免疫前血清以同样稀释倍数进行稀释后，放置在室温下进行2h孵育，以除去一抗，再使用浓度为0.01moL/L的PBS进行3次清洗，去除PBS，在避光条件下，再加入比例为l：50的FITC对TRITC和山羊抗小鼠IgG（CHEMICON公司提供）进行标记的山羊抗兔IgG（CHEMICON公司提供）的混合荧光二抗，再继续在避光及室温的条件下进行1h孵育。最后将荧光二抗除去后，在避光条件下，以浓度为0.OlmoL/L的PBS进行3次清洗，去除PBS后，再加入比例为l：1000的DAPI50μl，在避光及室温条件下进行5min孵育，将DAPI除去后，再在避光条件下，以浓度为0.OlmoL/L的PBS进行3次清洗，去除PBS后，以无自发荧光的缓冲甘油封片剂进行封片。 1.2.3 图像分析：使用的是正立式生物荧光显微镜（Olympus公司生产，型号：BXSl）及其自带的图像重叠软件DPManager进行图像重叠，观察CD4+CD25+同表达的区域；若重叠部分呈强黄色荧光，则为阳性反应，并以图像分析的软件Image Pro-Plus6.0版本对相关的阳性表达的细胞比例及数量进行计算，对每个标本选择10个具有代表性的视野进行检测，并取其均值。 1.3 统计学方法：本组测定的数据经SPSS软件13.0版本检验，计量单位以χ±s表示，期间采取t检验，以P＜0.05为有统计学意义。 2.结果 2.1 成像特征：①两组受检者的CD4、CD