小鼠胚胎干细胞（mES细胞）、小鼠iPS细胞培养Protocol.DOCVIP

小鼠胚胎干细胞（mES）、小鼠iPS细胞培养Protocol MEF细胞铺制： 1. 在T25培养瓶中加入0.2?明胶，摇匀后覆盖底面即可，于37℃细胞培养箱至少放置15 min以上。 2. 吸除0.2?明胶，加入事先水浴加热至37℃的MEF培养液T25培养瓶中加入5 ml MEF培养液。 3. 按实验需要：小鼠胚胎干细胞使用KM-r P3 MEF或CF-1 P3 MEF；小鼠iPS使用ICR-r P3 MEF复苏MEF若干支将冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75?酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 4. 将冻存管内细胞悬液转移至含2 ml MEF培养液的15 ml离心管内，以 1000 rpm离心5 min，离心后将上清液吸除另加入新鲜的MEF液1 ml，重悬后按照一个T25铺106的MEF细胞，平均加入到T25培养瓶，轻轻摇匀后置于37℃细胞培养箱。24 h以后可以传入小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞。 5. 复苏或传代小鼠胚胎干细胞或小鼠iPS细胞前，将T25培养瓶中的MEF完全培养液吸除，加入2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液轻轻冲洗一遍后吸除，加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液待用。 复苏： 1. 将小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞冻存管从液氮中取出，置于37℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75?酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。 2. 将冻存管内细胞悬液转移至含3?4 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液的15 ml离心管内，以1000 rpm离心5 min。 3. 离心后将上清液吸除，另加入新鲜的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液2 ml，吹打悬浮。 4. 重复吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。 5. 转移至1个已经铺好MEF细胞的T25培养瓶中培养。 6. 每天更换小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液。 传代： 一般在复苏后第2?3天传代，视克隆大小和密度而定。 吸除废液。 用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。 加入1.0 ml的0.25?胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37℃培养箱内消化细胞。 在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1?2 min）。 加2 ml小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液终止消化。 多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。 加入足量的小鼠胚胎干细胞、小鼠iPS细胞完全培养液，吹打混匀，细胞悬液分装到铺好MEF细胞的T25培养瓶中一个培养瓶加入5?6 ml培养液。 放入37℃培养箱内培养。 每天换液。 传代比例：1?4?1?7 冻存： 按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。 以1000 rpm离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。 每支存管内加入500 ?l细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。 将冻存管置于程序降温盒内，-80℃过夜，转入液氮。 冻存液配方： 小鼠胚胎干细胞完全培养液或小鼠iPS完全培养液60?，ES级FBS 30?，DMSO 10? 附：小鼠胚胎干细胞与MEF细胞分离的简易方法（差速贴壁法）： 培养中的小鼠胚胎干细胞，按传代的操作方法将细胞用胰酶消化并吹打成单细胞悬液后，加入适量的提前温育好的小鼠胚胎干细胞完全培养重悬细胞，吹打混匀，细胞悬液分装到无MEF细胞的培养皿或培养瓶（一般地，一个T25培养瓶中培养的小鼠胚胎干细胞，在一个10 cm培养皿中进行差速贴壁。不要事先铺明胶，如铺明胶则细胞贴壁速度过快无法有效分离小鼠胚胎干细胞与MEF细胞）中。 培养皿或培养瓶置于37°C培养箱内静置1小时。 1小时后，绝大部分MEF细胞已贴在培养皿或培养瓶底面，而大部分小鼠胚胎干细胞仍然悬浮在培养液中。 收取培养液，进行后续实验。 中国科学院干细胞库/干细胞技术平台 第2页，共2页