第九章毛细管电泳 - 仪器信息网.doc

第九章 毛细管电泳 基本要求： 1. 理解毛细管电泳分离的原理； 2. 理解胶束电动毛细管色谱分离的基本原理； 3. 理解影响毛细管电泳与胶束电动毛细管色谱分离优劣的因素。 9.1 电泳基本原理 电泳指带电粒子在电场作用下作定向运动的现象。电泳有自由电泳和区带电泳两类，分析工作者感兴趣的是区带电泳。区带电泳是将样品加于载体上，并加一个电场。在电场作用下，各种性质不同的组分以不同的速率向极性相反的两极迁移，此时不考虑样品与载体之间的相互作用，因此电泳不是一个色谱分离过程。实际上，样品与载体之间总有一定作用力，人们就利用这种作用力，并与电泳过程结合起来，以期得到良好的分离。因此，电泳又称电色谱。区带电泳总是在固体或类固体这类载体上进行，常用载体有滤纸（故称纸电泳）、凝胶（故称凝胶电泳），以及醋酸纤维膜、淀粉、琼脂高聚物等。 图9-1 区带电泳设备示意图 电泳设备简单，操作方便。图9-1就是区带电泳设备的示意图。在左右两边的电解质贮槽中，放入合适的电解质溶液，载体架于两槽之间。电解液通常是一种缓冲液，浓度约0.1mol·L-1。电解液体积要大，以防止电解产物扩散至载体上，最好在浸入载体的电解液与插入电极的电解液之间有一隔板。载体上所加电压梯度为每厘米数十伏。高电压可以加速迁移，缩短分析时间，但电压梯度须增至每厘米数百伏。可将样品加入其载体一端的起始点。在各组分分离之后，用合适的方法，如喷洒显色剂、紫外光照射等，使组分斑点出现，然后进行定性和定量分析。 9.2 高效毛细管电泳装置 将开管柱气相色谱理论与技术应用于经典电泳，从而诞生了一种新的高效的分离模式，高效毛细管电泳(high performance capillary electrophoresis, HPCE)。它的性能在分离许多生化物质上要优于一般色谱法。 毛细管电泳仪装置如图9-2所示。 图9-2 毛细管电泳仪结构示意图 高压电源供给Pt电极上的电压高达5-30kV。典型毛细管长约10-100cm，内径为25-100μm，其材料可以是熔融石英。为了分离需要，也可采用预先经化学或物理吸附改性的毛细管。一般通过加压到电解质缓冲剂容器中或在毛细管出口减压，强使溶液通过毛细管。两端缓冲剂必须定期更换，这是由于在实验过程中，离子不断地被消耗，阴极和阳极缓冲液的pH值升高或降低。 被分析样品的加入可以通过两种方法来实现。一是重力注射，即把毛细管一端浸没在样品溶液中，将此溶液提升，超过另一端缓冲液液面约10cm，使样品进入毛细管。二是电动进样，即在数秒种内，加5KV的短脉冲，由于电渗流的作用，使5-50μL的样品进入毛细管。 常用的检测器有紫外吸收检测器，二极管阵列检测器、荧光检测器、采用碳纤维的安培检测器，以及电导检测器等。 9.3 电渗流迁移率 毛细管电泳分离的一个重要特性是毛细管内存在电渗流。电渗流的来源如图9-3所示。当缓冲液的pH在4以上，石英管壁上的硅醇基(≡Si-OH)离解生成阴离子(≡Si-O-)，使表面带负电荷，它又会吸引溶液中的正离子，形成双电层，从而在管内形成一个个紧挨的“液环”。在强电场作用下，它自然向阴极移动，形成了电渗流。电渗流迁移率大小与缓冲液的pH值高低及离子强度有密切关系。pH值越高，电渗流迁移率越大；离子强度越高，电渗流迁移率反而变小；在pH为9的20mmol·L-1的硼酸盐缓冲液中，电渗流迁移率的典型值约为2mm·s-1。pH值越小，硅醇基带的电荷越少，电渗流迁移率越小；pH值越大，管壁负电荷密度越高，电渗流迁移率越大。若在管内壁涂上合适的物质或进行化学改性，可以改变电渗流的迁移率。例如蛋白质带有许多正电荷取代基，会紧紧地被束缚于带负电荷的石英管壁上，为消除这种情况，可将一定浓度的二氨基丙烷加入到电解质溶液中，此时以离子状态存在的+H3NCH2CH2CH2NH3+，起到中和管壁电荷的作用。也可通过硅醇基与不同取代基发生键合反应，使管壁电性改变。 图9-3 电渗流的形成 在外加强电场之后，正离子向阴极迁移，与电渗流方向一致，但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移，但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率，因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。可见正离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明，不电离的中性溶剂也在管内流动，因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。 在外加强电场之后，正离子向阴极迁移，与电渗流方向一致，但移动得比电渗流更快。负离子应向阳极迁移，但由于电渗流迁移率大于阴离子的电泳迁移率，因此负离子慢慢移向阴极。中性分子则随电渗流迁移。可见阳离子、中性分子、负离子先后到达检测器。实验证明，不电离的中性溶剂也在管内流动，因此利用中性分子的出峰时间可以测定电渗流迁移率的大小。 9.4 影响分离的因素 9.4.