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454高通量测序方法 取适量污泥发酵混合液在10000rpm条件下离心5min， 然后使用OMEGA 公司 E.Z.N.A Soil DNA试剂盒抽提基因组DNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA合格后，利用引物27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和533R(5’-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3’) 对细菌的16S rRNA的V1-V3区域扩增。 PCR 采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系包括：4 mL 5× FastPfu Buffer, 2.0 mL 2.5 mM dNTPs, 0.4 mL 前引物, 0.4 mL 反向引物，10.0 ng DNA 模板以及0.4 mL FastPfu Polymerase (TransStart FastPfu DNA Polymerase,TransGen). PCR扩增程序如下：先在95℃反应2min，然后进入扩增循环，每一次扩增循环分别在95℃，55 ℃和72℃温度下保持30s，共进行循环25次，最后在72℃保持5min，最后在10℃条件下5min褪火结束反应。每个样品3个重复，将同一样品混合后用2%琼脂糖凝胶电泳，使用AXYGEN 公司的AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris_HCL洗脱；将已构建好的PCR产物文库参照电泳初步定量结果，，借助Promega公司的QuantiFluor? -ST荧光定量系统，用PicoGreen? dsDNA 定量试剂盒(PicoGreen? dsDNA Quantitation Reagent) 进行检测；获得标准曲线并对PCR产物文库定量，然后按每个样品的测序量比例混合，并使用Roche 指定的 （Roche emPCRAmp-Lib_L Kit）制备EmPCR产物，在Roche Genome Sequencer FLX + 进行上机测序。最后对数据进行分析优化，丢弃长度短于200bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列，获得优化序列数据。使用Furthest neighbor 方法（/wiki/Cluster）聚类生成OTU(按相似度97%)并进行生物信息统计分析。 数据分析结果如下：  表1. 不同发酵系统中高通量测序数据有效性总结 Sample ID α = 0.03 α = 0.05 Reads OTUs ACEa Chao1 Shannon OTUs ACE Chao1 Shannon Control 7603 2909 17398 8869 7.12 2442 10596 6325 6.85 nZVI 8098 2602 13627 7094 6.74 2204 10290 5691 6.47 Chao：是用chao1算法估计样品中所含OTU数目的指数，chao1在生态学中常用来估计物种总数， Ace：用来估计群落中OTU数目的指数，由Chao提出，是生态学中估计物种总数的常用指数之一， Shannon：用来估算样品中微生物多样性指数之一。它与Simpson多样性指数常用于反映alpha多样性指数。Shannon值越大，说明群落多样性越高。 微生物结果分析： 图1. 空白和nZVI反应器中微生物文氏图 (97%相似度) 目前，454高通量测序方法作为一种分析微生物种群结构优选方法已广泛应用于环境样品中，如污泥和土壤样品。本课题采用454高通量测序方法研究nZVI的加入对厌氧发酵产酸系统中的微生物种群结构和丰度进行深入分析。实验结果表明nZVI加入改变了发酵系统中的微生物种类和丰度，与空白反应器相比仅有748个OTUs（占总OTUs的13.5%）相同（图1），充分说明厌氧发酵系统的微生物结构已经发生变化。图2（A）heatmap图显示了加入nZVI和空白反应中，微生物在门类水平的分布情况，由图可以看出每个反应中都有21个门的微生物种类被检出，而主要的微生物门类包括Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Chloroflexi 和 Actinobacteria, 分别占总数的的88.2% （空白反应器）和88.8% (nZVI反应器) 。这些门类的微生物在厌氧发酵过程中的有机物的降解以及短链脂肪酸的形成起着重大作用。如Firmicutes 门类的细菌是厌氧第1 阶段的主要菌群，能够在水解酸化过程中产生纤维素酶、蛋白酶和各种胞外水解酶，并通过新陈代谢来降解纤维素、蛋白、多糖和氨基酸等有机物，是纤维素等复杂大分子的主要降解菌；Bacteroidetes 门类的细菌是污泥中温消化的主要降解菌，能够降解多糖等有机物