组织中总RNA提取.docVIP

组织中总RNA的提取 实验前：离心机预冷（4℃），干烤过的研钵，杵，（用锡箔纸包着干烤）主要实验在铺着报纸的桌上进行。 操作要求戴口罩，手套要求新的，枪头，EP管全部无酶。 一、1)液氮研磨，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软（仅可软一次），乘它是软的，把它压平，继续研磨。若液氮挥发完要迅速补充液氮，一直让样品保持冻着的状态。磨到差不多的时候，聚组织于一堆，加1000mlTrizol在它们上面。锡箔纸盖住研钵室温静置10Min左右，至混合液溶解。 注意：最好不要等组织变软，变软后RNA容易降解。但是软一次，实验证明没事的，压平后很容易磨碎。其实冻着状态更容易磨碎。磨的时候，小心组织飞掉。飞掉的话，我们是捡回来的。研磨这步很重要，研磨既要充分又不能让RNA降解，磨到粉末状。按50-100mg 组织/ml Trizol 加入Trizol。Trizol裂解细胞，促使核蛋白复合体解离，而且有效抑制RNase活性。 2) 吸入混合液于无酶的1.5mlEp管中，再加200ul（一般）氯仿，用手剧烈震荡30s，室温放置15Min。 注意：加氯仿使RNA进入离心后的上层液体中 3）4℃ 12000g离心15Min 4）取上清于另一个EP管中，再加200ul氯仿，吹打混匀，同样条件再离心一次。 5）吸上清于另一个EP管中 注意：不可全吸，防止吸入下面的杂质。 6）加入等体积的异丙醇（一般500ul），室温放置5—10Min。 注意：此步沉淀RNA. 也可以放入-20度，先吃饭。 7）4℃ 12000g离心10Min 弃上清 8）加入1ml 75%乙醇，温和震荡得沉淀 9）4℃ 8000g 离心5Min 尽量弃上清 10）室温干燥 5---10Min（倒扣于滤纸上，EP管盖子打开） 11）10ul的DEPC水溶解，吹打混匀。 12）19ulDEPC水于另一支EP管中，从11）中取1ul于其中吹打混匀测OD值。11）中的RNA-80度保存。12）中的测完后弃掉。