表皮干细胞体外培养和其应用.docVIP

大鼠表皮干细胞的分离培养及其应用 表皮干细胞是来源于胚胎外胚层皮肤组织的专能干细胞，主要分布于表皮基底层和毛囊隆突部，形态学上具有未分化细胞的特征，在生物学方面是皮肤及其附属器发生、修复、改建的源泉。在一定条件下，干细胞可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”。它不仅在体内平衡和创伤修复中起关键作用，而且是基因治疗的主要靶标[1-2]。因此，成功地分离、培养表皮干细胞对医学临床上创伤修复、皮肤癌的研究也起着至关重要的作用[3-5]。在表皮干细胞的研究当中，国内外学者主要以人或小鼠为研究对象[6-8]，而对大鼠的研究较少。本文则对以大鼠为研究对象，探讨表皮干细胞体外分离培养和鉴定方法的综诉，以期为进一步向表皮干细胞内转染基因的研究奠定基础。 1表皮干细胞的一般特性 1.1表皮干细胞的表达 表皮干细胞在人体不同部位皮肤的分布存在差异，头皮的毛囊隆突部及包皮和阴囊的皮肤基底层存在较多表皮干细胞，背部及四肢近端外侧皮肤基底层表皮干细胞相应地多于胸部及四肢近端内侧。 1.2表皮干细胞的结构 表皮由外向内分别由角质层、透明层、颗粒层、棘层和基底层组成;其中基底层又称为生发层，由单层柱状上皮组成，呈栅状排列于基膜带上，邻接真皮。根据细胞动力学分析，在表皮中有三种细胞：干细胞、短暂扩充细胞和终分化细胞，只有干细胞在体外培养能形成完全克隆 1.3表皮干细胞的生物学特性 具有未分化细胞的特征，表皮干细胞还具有:细胞体积小，核质比大，胞内细胞器稀少，细胞内RNA含量低等未分化细胞的特征。其两个显著生物学特性：①慢周期，细胞分裂缓慢，以便细胞的DNA发生最少的突变及能有充分的时间进行自我修复②自我更新，增值潜能强，离体培养呈克隆样生长。 2表皮干细胞分离培养 2.1表皮干细胞的制备 2.1.1组织块法制备细胞 无菌采取新生SD大鼠背部皮肤，用含高浓度双抗的无钙镁PBS充分清洗后，用眼科镊轻轻剥除真皮上的脂肪组织。将获得的表皮组织切割成0.2cm×0.2cm的小块，基地面朝下贴于35mm培养皿。待表皮与皿底贴附紧密而未干时滴加少量培养液（M199+200mL/L FBS+5Mg/mL insulin+0.5Mg/mL氢化可的松，下文中所提及的培养液均为此培养液）浸润组织块，置于体积分数为5%的CO2培养箱37?摄氏度，饱和湿度中培养24 h后，添加培养液至正常培养用量，隔天换液。待组织块周围细胞长至直径1cm~2cm时，消化传代。 2.1.2酶消化法制备细胞 无菌采取新生SD大鼠背部皮肤，用含高浓度双抗的无钙镁PBS充分清洗后，切割为0.3cm×1.0cm的长条形皮肤组织。将这些条形皮肤组织以2.0IU/mL中性蛋白酶在4摄氏度浸泡12h~16h，PBS冲洗，轻轻撕取表皮，剪碎呈穈状，以2.5g/L胰酶+0.2g/L EDTA消化液在37摄氏度消化5min~10min，用含血清的培养液中和并充分吹打，100目滤纸过滤，1000r/min离心5min，弃上清，以培养液重悬，接种于100mg/LⅣ型胶原预铺的35 mm培养皿中，37摄氏度培养箱卵育20min后，吸取培养液转移至其他培养皿中继续培养作对照，在原培养皿中加入新的培养液后继续培养。 2.2表皮干细胞分离纯化及传代培养 消化法制备细胞时待细胞生长至70%的融合率时便可消化传代。组织块法制备细胞时待组织块周围细胞长至1cm~2cm时，便可消化传代。 2.2.1室温消化 将培养皿内的培养液弃去后，用无钙镁PBS冲洗3遍，向培养皿内加入400mL消化液（2.5g/L胰酶+0.2g/LEDTA）消化约1min后，将消化液弃去，然后再向培养皿内加入400mL的消化液，消化5min后用等体积的培养液中和，吹打均匀，1000r/min离心10min，弃上清，用1mL的培养液吹打均匀后接种Ⅳ型胶原预铺的培养皿内中，将培养皿放入CO2培养箱中静置20min后，轻轻吸取未贴壁细胞转移至其他皿，并向原皿中添加培养液，放入CO2培养箱中培养，隔天换液。 2.2.2冷消化 将培养皿内的培养液弃去后，用无钙镁PBS冲洗3遍，向培养皿内加入400mL消化液消化约1min后，将消化液弃去，然后再向培养皿内加入400mL的消化液，置于4℃条件下消化。将培养皿从4摄氏度中取出之后用等体积的培养液中和，其他方法同室温消化法。 2.3 表皮干细胞的鉴定 从形态学上观察，表皮干细胞体积较小，形态较圆，核质比大，能够形成克隆。使用免疫细胞化学法鉴定。 ESCs单细胞克隆与克隆形成率的测定 将1代~3代的快速粘附细胞及未粘附细胞分别用培养基稀释成克隆密度（1个细胞/5mL溶液），按每孔100个细胞（0.5mL溶液）接种在铺有明胶的3.5cm六孔塑料培养板中，培养基培养，7天~9