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实验十二 质粒DNA的小量制备、电泳检测及细菌转化E.coli DH5(/pUC19 培养基：LB：Tryptone 1%，Yeast Extract 0.5%，NaCl 1%，pH7.2 (Agar 2%)；120℃灭菌20min。 D0001碧云天质粒小量抽提试剂盒（或其它公司的产品） 恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、台式高速离心机、台式小型振荡仪、 EP管（Eppendorf管，1.5ml微量离心管）、加样器、吸头等。 三 原理 实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。它是一种新型的离子交换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。 四 实验内容 细菌培养及菌体的收获。 用试剂盒进行小量质粒制备。 五 实验步骤 1. 将E.coli菌株接种到液体LB培养基中，加入氨苄青霉素至 100(g/ml，150rpm振荡16h； 2. 吸取1.5ml培养菌液与1.5ml离心管中，13000rpm室温下离心2min。倒掉上清，然后倒置于吸水纸上，使液体流尽； 3. 加入150(l溶液Ⅰ，vortex或弹起沉淀，使完全散开，无絮块。 4. 加入200(l溶液Ⅱ，颠倒离心管6~8次，使细菌完全裂解，溶液透明，注意不能振荡； 5. 加入500(l溶液Ⅲ，颠倒6~8次，可见白色絮状物产生； 6. 13000rpm离心10min。离心时准备好质粒纯化柱及最后的质粒收集管； 7. 直接将上清液倒入质粒纯化柱，13000rpm离心1min，使质粒结合于纯化柱上； 8. 倒弃收集管内的液体，在质粒纯化柱内加入750(l溶液Ⅳ，13000rpm离心1min，洗去杂质； 9. 倒弃收集管内液体，13000rpm离心1min，除去残留液体； 10. 将质粒纯化柱放在质粒收集管上，加50ul溶液Ⅴ至管内柱面上，放置1min； 11. 13000rpm离心1min，所得液体就是质粒。质粒于-20℃冰箱保藏备用。 六 注意事项 在使用前，在溶液Ⅳ（洗涤液）加入40ml无水乙醇或43ml95%乙醇，然后在瓶盖上作好记号。 溶液Ⅱ在温度较低时，可能会产生沉淀，需先用水浴加热溶解，混匀后再使用。溶液Ⅱ易被空气中的CO2酸化，用完后应立即盖紧瓶盖。 七 思考题 加入溶液Ⅱ后，为什么不能剧烈振荡？ 附录一：pUC19图谱 Ⅱ. 质粒DNA的电泳检测 一 实验目的 学习并掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的技术。 二 实验材料 琼脂糖，TAE缓冲液，加样缓冲液，溴化乙锭（EB），标准分子量Marker 电泳仪、稳压电源、凝胶电泳成像仪等 三 实验原理 琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的有效方法。琼脂糖凝胶的分辨能力要比聚丙烯酰胺凝胶低，但其分离范围较广。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA.。琼脂糖凝胶通常采用水平装置在强度和方向恒定的电场下电泳。直接用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭进行染色，可确定DNA在凝胶中的位置。 四 实验内容 对所提取的质粒DNA样品进行电泳检测。 五 实验步骤 1. 制胶（见图3） (1) 胶模两端用胶带封严，架好梳子备用； (2) 称取0.2g的琼脂糖于100ml烧杯中，加入20mlTAE，加热熔化至无颗粒状琼脂糖，冷却到60℃左右加入EB（终浓度0.5(g/ml），摇匀，即倒入胶模中凝固30min以上； (3) 临用前，撕去封口胶带，放入电泳槽中，倒入适量的电泳缓冲液TAE（淹过胶面），拔取梳子备用。 2. 样品准备 取已提取好的质粒DNA 5(l于500(l指管中，加入1(l的加样缓冲液，混匀； 3. 电泳 (1) 将样品和5(l标准分子质量分别点样到梳孔中； (2) 恒压50v，电泳60分钟左右； (3) 电泳结束后关闭电源，取出凝胶，用凝胶成像仪进行摄影和记录。 图3 灌制水平琼脂糖凝胶 六 实验结果 将质粒DNA条带与DNA MW Marker进行比对，对质粒提取结果进行分析。 七 注意事项 溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用含有这一染料的溶液时务必戴上手套，这些溶液经使用后应按下面介绍的方法进行净化处理。 附录一 溴化乙锭稀溶液的处理 (适用于含有0.5(g/ml的溴化乙锭的电泳缓冲液) 方法一 每100ml溶液中加入2.9g Amberlite XAD-16,这是一种非离子型多聚吸附剂,可向Rohm Haas公司购置； 于室温放置12小时，不时摇动； 用Whatman 1滤纸过滤溶液，丢弃滤液； 用塑料袋封装滤纸和Amberlite 树脂，作为有害废物予以丢弃。 方法二 每100ml溶液中加入100mg粉状