抗间日疟原虫GDH特异性单抗的大量制备和纯化.ppt

抗间日疟原虫GDH特异性单抗的大量制备及纯化 主讲人：江云 背景 疟疾是一种由媒介按蚊传播的传染性寄生虫病，全球广泛流行，我国也深受其害，发病以间日疟为主，虽然我国已成功启动了消除疟疾行动计划，但本世纪前十年曾经出现中部间日疟疫情回升，表明疟疾控制态势仍然脆弱。间日疟原虫感染病例血液中的原虫密度通常较低，由于漏诊病例有可能成为当地传播的潜在传染源，因此，及时有效地发现病例，无论是在疟疾控制阶段，还是疟疾消除进程中，都具有十分重要的意义。 显微镜血涂片检查是经典疟疾诊断实验，不但需要器材，操作费时费力，检测结果很大程度上依赖于镜检人员的经验和责任心，在疟疾低流行区漏检率高，已不能满足当前疟疾消除的高要求。近年来，基于免疫层析的疟疾快速诊断技术（Rapid Diagnostic Tests, RDTs）发展较快，因其特异性和敏感性均较高，无需仪器设备，操作简单，结果易判读，实施较为方便，非常适合疟疾现场应用，然而，迄今为止，仍无适合间日疟诊断的RDT可用，主要原因在于缺少敏感度高，特异性强的间日疟原虫靶抗原，由于我国以间日疟流行为主，迫切需要研究开发适合现场应用的间日疟快速诊断技术。 间日疟原虫（Plasmodium vivax, P.v）的体外培养技术尚不成熟，难以提供大量实验材料，从感染者采集的血样，其疟原虫密度低，且含有难以去除的宿主白细胞，因此，高纯度的间日疟原虫样本材料来源困难，已成为探寻间日疟原虫特异性抗原的重要瓶颈之一。通过基因重组表达制备的蛋白纯度高，抗原性和天然蛋白类似，可成为解决缺少间日疟原虫特异性诊断抗原的新途径之一。 有研究表明，疟原虫谷氨酸脱氢酶GDH具有独特的理化，生物学及酶学特性，而且宿主红细胞内没有此酶，从而成为指示疟原虫感染的标志物。GDH是一种普遍存在于生物体内对碳和氮代谢起重要作用的酶，在疟原虫整个红细胞内期均能表达，它催化谷氨酸脱氨基生成酮戊二酸， 同时使辅酶I和II，由氧化型NAD和NADP转化为还原型NADH和NADPH。 疟原虫GDH是NADPH生成的主要来源，而且更为重要的是，宿主红细胞内没有此酶（GDH-NADPPH）。因此该酶有望成为疟疾快速诊断的新型候选分子。 实验方法 1.杂交瘤细胞的复苏与培养 从液氮中取出的细胞冰存管，置于37摄氏度水中融化，至仍有少量冰存在时，吸取细胞加至已装有适量1640培养基的进口瓶中，放入恒温二氧化碳细胞培养箱内。第三天，选取生长良好的一瓶，将培养液全部倒出，再加入适量新配制的1640培养液，继续放入细胞培养箱中培养，重复此步，直至镜下观察细胞贴满瓶壁。 2.抗间日疟原虫GDH蛋白的杂交瘤细胞体内腹水培养 用注射器吸取5ML的吹打混匀的细胞培养悬液，注入10天前预先注射过石蜡油的小鼠腹部，正常饲养两周，选出腹部明显隆起的小鼠，将其处死固定于超净台上，小鼠用75%酒精浸泡1min，用无菌眼科剪小心剪开腹壁皮肤和肌肉，完全暴露腹膜，用装有适量肝素的5ML的一次性注射器将腹水迅速吸至细胞离心管中，立即摇匀以防凝集。 3. Protein G-琼脂糖亲和层析法纯化小鼠单抗 Protein G蛋白G能够和小鼠IgG的各个亚类均能发生结合，因而将Protein G固定结合于琼脂糖珠颗粒上，形成固相吸附相，当含单抗的小鼠腹水或杂交瘤上清通过含有Protein G-琼脂糖珠的层析柱，单抗被特异性结合到柱子上，经过洗涤去除非特异性结合的杂蛋白，再通过洗脱而获得纯化的单抗IgG蛋白。 取小鼠新鲜制备的腹水，经4000rpm离心30分钟，以去除脂类等杂质。取透明的腹水液体加入等量的0.15M 的PBS混匀，再加入两倍于腹水体积的饱和硫酸铵溶液，于40C的冰箱内放置2小时，然后经4000rpm离心30分钟，吸弃上清，将沉淀用PBS稀释为原腹水体积的3倍量，按1ml/min缓慢通过层析柱（柱床体积为1ml），然后用10个柱体积的PBS通过柱子以充分洗涤去除柱子内残留的杂蛋白。再用10倍于床体积的0.1M 甘氨酸-HCl通过层析柱，分管收集，每管收集1ml，测定各管的蛋白浓度，合并蛋白含量高的收集管，经上述的超滤管离心浓缩，经考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度，于-200C冻存备用。 4.纯化的抗间日疟原虫GDH单抗的纯度鉴定—SDS电泳 1．安装夹心式垂直板电泳槽 2．分离胶制备：按表配制20ml 15%分离胶，混匀后用细长头滴管将凝胶液加至长、短玻璃板间的缝隙内，约8cm高，用1ml注射器取少许蒸馏水，沿长玻璃板板壁缓慢注入，约3—4mm高，以进行水封。约30min后，凝胶与水封层间出现折射率不同的界线，则表示凝胶完全聚合。倾去水封层的蒸馏水，再用滤纸条吸去多余水分。 3.浓缩胶的制备：按表配制10ml 3%浓缩胶，混匀后用细长头滴管