金葡菌类肠毒素K原核表达载体构建及其生物学活性分析.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（１２）：４５５０ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 金葡菌类肠毒素Ｋ原核表达载体构建 及其生物学活性分析 １，２ １ １ １ １，２ 刘彦礼 　牛荣成 　杨　芬 　朱文慧 　林俊堂 （１新乡医学院生命科学技术学院　新乡　４５３００３　２河南省医用组织再生重点实验室　新乡　４５３００３） 摘要　目的：金葡菌类肠毒素Ｋ（ＳＥｌＫ）原核表达载体构建及其生物学活性初步分析。方法：通过 常规分子生物学技术将ＳＥｌＫ基因片段插入载体ｐＥＴ２８ａ中，阳性单菌落扩大培养，诱导目的基因 ＋ 表达后通过Ｎｉ亲和层析纯化ＳＥｌＫ重组蛋白；小鼠脾淋巴细胞增殖实验及尾静脉注射后血常规 检测ＳＥｌＫ超抗原活性；进一步通过检测血清中谷丙转氨酶（ＡＬＴ）、谷草转氨酶（ＡＳＴ）、乳酸脱氢 酶（ＬＤＨ）和肌酸激酶（ＣＫ）活性及尿素（Ｕｒｅａ）和肌酐（ＣＲ）含量来评价ＳＥｌＫ潜在肠毒性。结果： ＋ 成功构建ＳＥｌＫ原核表达载体，并通过Ｎｉ亲和层析获得高纯度ＳＥｌＫ重组蛋白（＞９５％）；随后的 超抗原活性检测发现ＳＥｌＫ能够在体外刺激小鼠脾淋巴细胞显著增殖，尾静脉注射后能够有效地 刺激血液中淋巴细胞增殖；最终的肠毒性检测结果发现 ＳＥｌＫ能够显著增加血清中ＡＳＴ活性及 Ｕｒｅａ含量。结论：成功构建并纯化获得高纯度 ＳＥｌＫ重组蛋白，并对其超抗原活性及潜在肠毒性 进行初步分析，为开发更优的抗肿瘤制剂提供备选药物。 关键词　超抗原　金葡菌类肠毒素　Ｔ淋巴细胞　血常规　肠毒性 中图分类号　Ｑ８１９ 　　 作 为典 型 的细菌超抗原，金葡菌肠毒素 　　近年来，随着对 ＳＥｓ生物学活性研究的深入，发现 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｓ，ＳＥｓ）只需极低浓度（ｐｇｎｇ 致呕吐毒性不是所有金葡菌超抗原所必须的。因此 级）即可特异性地激活Ｔ淋巴细胞库中５％～２０％的细 ２００４年国际命名委员会 （ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ 胞，释放大量细胞因子，强化其所依赖的细胞介导的细 Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）将 ＳＥｓ中缺乏致呕吐毒性或者致呕吐毒性 胞 毒 作 用 （ｓｕｐｅｒａｎｔｉｇｅｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｍｅｄｉａｔｅｄ 还未验证的命名为金葡菌类肠毒素 （ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，ＳＤＣＣ），促使机体产生较强的免疫应 ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎｌｉｋｅ，ＳＥｌ），而已确认的无致呕吐毒性的成员 ［１２］ ［９］ 答 。因此，针对 ＳＥｓ的超抗原特性，国外已广泛开 包括 ＳＥｌＨ、ＳＥｌＫ、ＳＥｌＬ和 ＳＥｌＱ 。本研究首先构建 ＋ 展ＳＥｓ用于癌症治疗的临床前研究，而国内沈阳协合 ＳＥｌＫ原核表达载体，Ｎｉ亲和层析获得重组 ＳＥｌＫ蛋白 集团开发的以金葡菌肠毒素 Ｃ２（ＳＥＣ２）为主要成分的 纯品；进一步检测其刺激小鼠脾淋巴细胞增殖活性，并 抗肿瘤产品“高聚生”，经各类癌症患者的临床应用证 分析体内注射后对小鼠血常规及主要脏器关键酶活性 实效果显著，并且与放疗或化疗联合使用时效果更 的影响，为将ＳＥｌＫ开发为新型抗肿瘤生物制剂提供理 ［３６］ 论支持。 佳 。然而ＳＥｓ自身所存在的肠毒性，在大剂量使用 时能够诱发机体出现催吐、腹泻和发热等毒副作用，在