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光合细菌培养基配方的优化研究 摘要:光合细菌培养基的组分是由乙酸钠、氯化铵、磷酸二氢钾、硫酸镁、酵母膏等5种原料构成。采用L16(45)正交表,将5种原料作为光合细菌生长有影响的因素,通过试验数理统计的直观和理论分析,对其配方进行优化。试验结果表明,当培养基的配方为乙酸钠3. 3 g/L、氯化铵0. 6 g/L、磷酸二氢钾0. 9 g/L、硫酸镁0. 5 g/L、酵母膏1. 5 g/L、光照3 000 lx和温度(32?2)e时,培养72 h即可达到生长峰值,细菌总数可以从起初的1. 75@109cfu/mL提高到3. 19@109cfu/mL。优化的培养基条件能有效促进光合细菌生长。 关键词:光合细菌;标准曲线;平板菌落计数;正交试验设计;培养基优化 1 试验材料 试验菌种:光合细菌(Photosynthetic Bacteria, PSB)由山东省淡水水产研究所分离、提纯、培养 而获得,主要菌种为沼泽红假单胞菌。 液体培养基基础配方:乙酸钠2. 5 g,酵母膏 2. 0 g,MgSO40. 5 g,NH4Cl 1. 0 g,KH2PO40. 5 g 和无菌水1 000 mL[1]。 固体培养基(用于平板菌落计数)配方:牛肉 膏1. 5 g,蛋白胨5. 0 g,NaCl2. 5 g,琼脂7. 0 g和 无菌水500 mL[1]。 主要仪器:生化培养箱LRH)150B,紫外线 分光光度计Cary 100,自控振荡机ZD,显微镜O- lympus CX41,蒸汽消毒器YXQG02,电子天平 AG204,振荡培养箱BS)IEA;无菌吸管,培养皿, 试管及试管架、三角烧瓶等常用试验室器皿。 主要试剂:乙酸钠,氯化钠,氯化铵,磷酸二氢 钾,结晶硫酸镁,碳酸氢钠均为分析纯(AR);蛋白 胨,牛肉膏,酵母膏和琼脂均为生化试剂(BR)。 2 试验方法 2.1 光合细菌浓度OD660值标准曲线的测定 2.1. 1 基本原理 用紫外线分光光度计进行光 学密度测定,来获得光合细菌不同标准浓度菌悬 液的OD660值[2],绘制光合细菌浓度OD660值的标 准曲线。 2. 1. 2 操作步骤 标记:取11支无菌20 mL试 管,用记号笔分别标明光合细菌浓度, 0. 00, 0. 01, 0. 02, 0. 03, 0. 04, 0. 05, 0. 06, 0. 07, 0. 08, 0. 09和 0. 10。 接种:分别用10 mL无菌吸管吸取光合细菌 菌悬液2. 0, 4. 0, 6. 0, 8. 0, 10. 0, 12. 0, 14. 0, 16. 0, 18. 0, 20. 0 mL分别放入20mL试管中,加入 液体培养基至20 mL,并用自控振荡机摇晃均匀。 2. 1. 3 OD660值测定结果 2007年6月2日,提 取不同标准浓度PSB菌悬液、液体培养基作空 白;选取波长660. 00 nm,光束模式为双光束自动 选择模式,进行OD660测试,其回归方程为: y=0. 506 01 x (r= 0. 999 07) 式中, x为光合细菌浓度; y为OD660值;A为截距; B为斜率。 2. 2平板菌落计数法试验 2. 2. 1操作步骤 取无菌培养皿9套,将光合 细菌菌悬液依次稀释至10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7。置入自控振荡机上振荡,使菌 液充分混匀。用3支1 mL无菌吸管分别吸取 10-5、10-6和10-7的稀释菌悬液各0. 1 mL,分别 放入已做好固体培养基平板的培养皿中,并用玻 璃涂棒将菌液涂布均匀。每种稀释浓度3个设置 重复,及时放入生化培养箱中,调至(32?2)e, 进行光照培养。培养48 h后,取出培养平板,对 各培养皿中形成的菌落计数,算出同一稀释度3 475渔业现代化62007年第34卷第6期 个平板上的菌落平均数,并按下列公式进行计算: 1 mL中菌落形成单位(cfu)=同一稀释度3 次重复的平均菌落数@稀释倍数@10[1] 2. 2. 2试验结果 (1)平板菌落计数结果(表1) (2)PSB菌悬液OD660值测试结果(表2) 表1培养后菌落计数结果表 稀释度10-5 1 2 3平均 10-6 1 2 3平均 10-7 1 2 3平均 cfu数/平板2 262 1 816 1 983 2 020. 3 267 281 226 258 31 42 33 35. 3 cfu数/mL 2. 02@1092. 58@1093. 53@109 注:采集时间为2007-06-06 15: 10: 15;光合细菌(PSB)菌悬液平均浓度=2. 71@109个/mL。 表2培养时光合细菌(PSB)菌悬液OD660值测试表 样品浓度度数值 (g/L) 浓度平均值 (g/L) 平